一、精子评估
(一)精液液化
由于精囊分泌的凝固蛋白的作用下,排出体外的精液呈半固体凝胶的团块,室温下几分钟后在前列腺分泌的蛋白酶的作用下开始液化,通常在15 min内精液完全液化。而超过60 min未液化者称之为液化延迟,可通过标本加入等体积的生理培养液(如Dulbecco 磷酸缓冲液)并用加样器反复吹打;或用18号钝头的注射器反复吸进推出;也可用菠萝蛋白酶消化。
(二)精液黏稠度
精液液化后,通过将精液轻轻吸入移液管或玻璃棒插入精液标本,使精液借助重力滴下,正常精液将形成不连续的小滴滴下,若拉丝长度超过2 cm为不正常的黏稠度。
(三)精液外观
正常精液呈均质灰白色的外观。有红细胞时精液为红褐色;而黄疸患者,服用维生素或生殖道严重感染时为黄色。
(四)精液体积
精液体积主要由精囊和前列腺,包括少量的尿道球腺和附睾分泌的液体组成,所以精确测量精液体积是精液评估的基础,建议用称重法,以避免体积测量法带来精液的残留或损失。方法是根据重量间接计算精液体积,先称取容器的重量,并称取装有精液的容器的重量,取精后计算重量之差,推算精液体积。将精液转移到其他容器中测定体积是不可取的,可能造成体积的测定值偏低0.4~0.9 mL。
(五)精子浓度和精子计数
精液常规分析是评估男性生育能力的最基本的检查方法,精子浓度是其中的重要指标之一。《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》认为精子浓度不同于精液密度,它是指每单位体积内精液中所含精子的个数,是由精子总数和稀释精子液体体积的函数换算来的。而精子总数是指一次完整射精的精液中所含的精子总数,反映了睾丸产生精子的经历和男性输精管道通畅的程度。
虽然血细胞计数板是精子计数的经典方法,但血细胞计数板用于精子计数时结果差异较大,且明显高估精子计数结果,这可能与血细胞计数池为一开放池、计数时精液样本需要稀释,而且分析过程受周围环境条件、蒸发、加样及分析时间等影响有关。随着检验技术的飞速发展,用于精液检测的工具也在不断更新,除常用的Makler计数板还出现了Macro、MicroCell、Cell-VU等计数板及计算机辅助精液分析系统。这里以血细胞计数板为例。
1.血细胞计数板(https://www.daowen.com)
血细胞计数板有两个独立的计数池,每个计数池有一个刻在玻璃表面的微小网格(3 mm×3 mm),每个计数区域划分为9个1 mm×1 mm的网格。每个网格的深度是100μm,容积是100 nL。第1、3、7、9号4个网格,每个网格含有4排,每排4个方格,每个方格容积是6.25 nL;第2、8号2个网格含有4排,每排5个方格,每个方格容积是5 nL;第4、6号2个网格含有5排,每排4个方格,每个方格容积是5 nL;中央的第5号网格含有5排,每排5个方格,每个方格容积是4 nL。第5号网格有25个方格,每个方格分为16个更小的方格。因此,第1、2、3、7、8、9号网格,每个网格含有4排,每排容积是25 nL;第4、5、6号网格,每个网格含有5排,每排容积是20 nL。
2.计数程序
将稀释精液样本加入血细胞计数板的计数池中,综合评估血细胞计数板的两个计数池内的精子数目,若两个计数池得出的数值十分一致,则认为取出的样本可代表精液标本。
(六)精子活力评估
1.精子活力的分级
精子的前向运动与受孕存在密切关联。《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》对每个精子的活力可分为前向运动、非前向运动、不运动三个等级。
(1)前向运动(PR):精子主动地呈直线或沿一大圆周运动,不管其速度如何。
(2)非前向运动(NP):所有其他非前向运动的形式,如以小圆周泳动,尾部动力几乎不能驱使头部移动,或者只能观察到尾部摆动。
(3)不运动(IM):没有运动。
以前将前向运动精子分为快速和慢速,以37℃时速度>25μm/s作为a级,但是对于技术员来说,很难如此精确无误地判断前向运动,新的分类方法更具有可操作性。
2.精子湿片的制备
制备一个20μm的湿片,在室温或37℃检测精子活力,以允许精子自由运动为佳。可根据盖玻片的面积不同,选择不同的液体体积,以保证20μm的深度[深度D(mm)=体积V(μL,mm3)/面积(mm2)]。