基于染色体芯片的胚胎植入前遗传学诊断技术
（一）CGH-array操作流程
1.全基因组扩增
可选用PCR方法或MDA方法获得 WGA-DNA。扩增时间视所选方法而定，可为3.5～16 h。扩增产物分2～5μL到2%琼脂糖电泳上检测（对照和样本放在一块胶上，指示剂可用GelRed或Goldview等）。
2.标记
约3 h，可延长至20 h。
（1）于冰上准备Cy3及Cy5标记混合液，分别与WGA-DNA（待检）及男性参照DNA（对照）混合标记，添加标记酶与引物缓冲液，于PCR仪上，37℃恒温反应2～4 h。如果需要，可以过夜。
（2）沉淀探针：取新EP管，标注样本编号，将Cy3标记的样本和相应Cy5标记的参照DNA混合。每管加入25μL Cotl-DNA和7.5μL 3 M醋酸钠用以封闭重复序列。每管加入206μL无水乙醇，颠倒混匀两次沉淀探针。-80℃冷藏10 min。
（3）洗涤探针：13 000 g离心10 min，弃去上清。加500μL70%乙醇，颠倒混匀，13 000 g离心5 min。弃去上清，点动离心。10μL移液器吸净残留的水。室温干燥2 min。
3.杂交
约3.5 h，可延长至20 h。
（1）预热两个水浴，分别设置为75℃和47℃，杂交混合液于75℃预热。
（2）标记好的产物中加入75℃预热的杂交混合液。置于75℃水浴2～3 min，振荡器混匀，点动离心。如此反复，直至沉淀完全溶解。
（3）置于75℃水浴10 min，冷却到室温。
（4）准备湿盒，2×SSC/50%甲酰胺变性液6～10 mL。加18μL样本于芯片杂交区域，盖盖玻片，芯片置于湿盒中，胶带封口。湿盒漂浮于预热的47℃水浴3～16 h杂交。
4.洗片
约30 min。准备试剂，组分参照芯片操作指南。
（1）倒入少许洗液1于单独的染缸内，将芯片从湿盒中取出在盛有洗液1的染缸内搅动，去除盖玻片。依次洗片，注意避光。
（2）放入50 mL离心管中，170 g离心3 min。
5.扫描
约30 min。
6.分析
视所选分析系统而定。
（二）SNP-array操作流程
芯片流程总共有九步，包括扩增产物经酶切消化、连接反应、PCR扩增、纯化、片段化、标记、杂交、洗脱及染色等步骤。不同芯片平台的操作流程略有差异。
1.消化
起始样本量250 ng，96孔板内，各样本中加入消化混合液14.75μL，总体积为19.75μL。PCR仪内设定程序：37℃，2 h；65℃，20 min；4℃保存。
2.连接
消化产物19.75μL加入连接反应混合液5.25μL，总体积为25μL。进入PCR仪内连接程序：16℃，3 h；70℃，20 min；4℃保存。
3.PCR
连接产物各加入无核酶水75μL稀释至体积为100μL。从中吸取30μL至新孔板，分三排，各加入PCR反应混合液90μL开启PCR程序。(https://www.daowen.com)
4.磁珠纯化
（1）每个标本PCR反应获得300μL产物，加入1 mL磁珠中。颠倒混匀后室温孵育15 min。最大转速离心3 min。
（2）将反应管置于磁力架上吸附磁珠，去除上清液。加入75%乙醇1.5 mL，颠倒混匀。涡旋器75%振力振荡2～4 min。最大转速离心3 min。
（3）再次将反应管置于磁力架吸附磁珠，去除上清液。重复离心30秒，吸附磁珠，20μL枪头去除底部余液。
（4）敞开管盖，室温干燥15 min，挥发剩余酒精。
（5）加入EB buffer 47～50μL，将磁珠弹散至混浊。涡旋器75%振力振荡10 min。最大转速离心5 min。取2μL稀释20倍测量OD值。若浓度大于200 ng/μL，则稀释至该值，每样本取45μL至新96孔板。
5.片段化
纯化产物45μL，各加入片段化缓冲液至总体积55μL。开启片段化程序：37℃，35 min；95℃，15 min；4℃保存。分离产物2μL用于4%琼脂糖凝胶电泳，鉴定片段化酶切效率。
6.标记
片段化产物总量53μL，加入标记混合液19.5μL，总体积为73.5μL。开启PCR仪标记程序：37℃，4 h；95℃，15 min；4℃保存。
7.杂交
杂交炉预热到49℃。标记产物中，每个标本加入190μL杂交混合液，开启PCR仪预杂交程序：95℃，10 min；49℃保存。当温度降到49℃，吸取200μL由进样孔注入芯片，贴纸密封芯片孔。芯片固定于杂交炉内，49℃杂交16～18 h。可过夜。
8.洗染
首先将洗涤工作站装载Wash A、B，在吸液针槽中装入空管，电脑控制开启预洗程序。待工作站预洗完毕，在洗液针槽中装载：SAPE洗染缓冲液600μL；抗体缓冲液600μL；1×芯片储存缓冲液820μL。取出芯片，去掉贴纸，200μL枪头吸出杂交液，换入1×芯片储存缓冲液，装满芯片内容量槽。将芯片装载入洗涤工作站，开启洗染程序。约需1.5 h。
9.扫描
洗染完毕，取出芯片，重新贴上贴纸，进入扫描仪，扫描约需30 min。其他芯片若未及时扫描，避光存放。
10.分析
视所选扫描分析系统而定。
（三）质量控制
1.全基因组扩增应设置空白对照（胚胎室来源）、阴性对照和gDNA阳性对照。
2.Array-CGH水浴每次使用前，需要用校准的温度计检测，并记录。
3.SNP芯片要求为96孔板操作，最好以24样本或48样本批次操作，排枪加样，避免手工操作差异，保证均一性。
4.SNP芯片操作步骤中片段化酶较敏感，低温反应，需避免温度起伏变化影响酶效率。
5.SNP芯片洗染后因加入荧光剂，需避光存放等待扫描，扫描前关注液体窗口内是否存在气泡，需把气泡赶走才能上机扫描。
6.实验操作由两人完成，一人操作，一人协助并记录。
7.某些软件自带质控分析，数据指标参照操作手册。
8.结果报告需要由两人核对完成。
9.所有样本都要在同一批次进行操作、分析，即保持同样的实验条件，包括：
（1）同一批样本同样时间、同样流程、同样试剂和同样的仪器设备上操作。
（2）每一批样本都包括test和reference样本。
（3）每一批样本都要有两个reference杂交区域。
（林晓潭）