两种主要冷冻方法
（一）程序冷冻法
胚胎冷冻的先驱 Mazur提出的方法，或称平衡冷冻法。基本过程是将胚胎放入含有一定浓度冷冻保护剂的冷冻液中处理后，慢速降温（0.2～2.0℃/min）至一个较低的温度（-35～-80℃）。在降温过程中胚胎会继续脱水。程序冷冻法已经应用多年，技术成熟，效果稳定，广泛地应用于IVF中原核期到囊胚期胚胎的冷冻保存，目前的IVF临床中，采用程序冷冻技术来冷冻保存早期胚胎仍占主导地位。IVF有关的试剂公司能够提供多种冷冻和复苏试剂盒。
程序冷冻法也用于精子和卵母细胞的冷冻保存。
多数程序冷冻法的方案中均包含以下几个关键步骤：①将胚胎放入含有渗透性冷冻保护剂的溶液中初步脱水，平衡；②然后将胚胎放入含有渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂的溶液中进一步脱水；③采用一定的降温程序，将胚胎及冷冻液体慢速降温到-80℃左右使胚胎进一步脱水，此过程中脱水原理是细胞外的冰晶形成；④为了促使细胞外冰晶形成，在降温的适当时期要使用“植冰”的技术；⑤降温结束后将胚胎放入液氮中储存；⑥复温时将胚胎快速升温到生理温度；⑦复温后应用含有非渗透性冷冻保护剂的复苏液使胚胎逐步复水，去除细胞内的渗透性冷冻保护剂。
基本原理：在程序中的脱水阶段，胚胎被放入含有一定浓度渗透性冷冻保护剂的冷冻液中。此时细胞外的渗透压较高，细胞内的水透过细胞膜流向细胞外，虽然渗透性冷冻保护剂也可以从高浓度的细胞外进入细胞内，但由于水的渗透速度更快，因此在刚进入冷冻液的开始阶段，随着水渗出细胞外，细胞体积因脱水而出现明显的皱缩。但随着时间的推移，细胞外的渗透性冷冻保护剂也逐渐进入细胞内，使细胞体积停止收缩，转而逐渐膨胀，直至恢复接近原来的大小。也就是出现细胞“先变小，后变大”的现象，这一过程的长短与细胞的大小、细胞膜的通透性、冷冻保护剂的种类、温度均有关。较高温度下，较小的细胞、渗透性强的冷冻保护剂可以达到更快的平衡。随后，通常将胚胎转移至含非渗透性冷冻保护剂的冷冻液中进一步增加细胞外的渗透压，使细胞持续脱水，体积进一步减少。以利于在随后的冷冻过程中，尽量减少冰晶的形成。脱水后的胚胎开始程序降温，当温度降到冷冻液的冰点以下时，需要进行植冰，诱导冰晶逐步形成，冰晶的形成伴随细胞外液体浓度增加，伴随着胚胎的进一步脱水，直至温度降到-80℃左右，进入液氮。
（二）玻璃化冷冻法
在自然界，有很多种在寒带生活的植物、昆虫和两栖动物能通过自然形成玻璃化的方式，在零度以下的环境中存活。北极蛙在冬季温度开始下降时，肝脏合成大量的甘油，使温度降至冰点下后北极蛙体内细胞处于玻璃化的状态，仍然能够生存。
玻璃化冷冻技术并非新技术，从前面对程序冷冻法的原理的描述中可以看出，程序冷冻法的实质是使冷冻标本的细胞外液形成冰晶，细胞内液充分脱水浓缩后达到玻璃化的状态。而我们所说的玻璃化冷冻法采用了更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温使细胞内外液体均达到玻璃化状态。因此可以这样说，对于细胞来讲，两种冷冻方法的本质相同。
十余年来开展玻璃化冷冻技术的中心逐渐增多，并且在不断的实践和改进中发现，玻璃化冷冻的结局不低于程序冷冻法，甚至优于程序冷冻。
基本原理：玻璃化是液态的物质在一定的降温速率下，由液相直接转变成为一种玻璃状的固体状态的过程，内部没有晶体结构。对于保存胚胎的溶液来说，这种玻璃状态由于内部没有冰晶形成，能保持其溶液状态的分子和离子分布。由于在培养液玻璃化的过程中没有形成冰晶，因此在冷冻和解冻的过程中冷冻液也不会在液态和晶体形态之间来回转换，从而避免了冰晶对细胞的物理化学损伤，可望获得更好的冷冻效果。但溶液要实现玻璃化状态，和液体黏滞系数、降温速率、总体积有关。要实现玻璃化状态，需要更高的液体黏滞系数、更快的降温速率、更小的液体总体积。
在降温阶段中，玻璃化的要求是越快越好，通常用每分钟降低的温度为衡量标准，降温速率与冷冻载体的类型、液体体积有关。由于相对高温的物体进入液氮后会有微量的液氮气化，在物体表面形成极薄的一层气体膜，起到保温作用，阻碍了温度的快速下降。
由于不能保证全部冷冻液中无任何冰核存在，因此在玻璃化法冷冻保存的复温过程中，如果升温较慢，和程序冷冻一样，玻璃化保存的液体也会发生重结晶，所以复苏也要采用快速复温的方法。
（三）玻璃化法的优势
1.设备要求低
玻璃化冷冻不需要专用设备，不必担心设备故障造成的医疗风险。即使一家中心具备程序冷冻仪，玻璃化冷冻技术仍可以作为备用手段，保证在冷冻仪出现故障时不造成冷冻胚胎的损失。(https://www.daowen.com)
2.节省人力
每冷冻一份标本，仅需10 min左右时间，对于周期数不多的中心，会明显低于程序冷冻的工作量。如果冷冻数量较多，由于玻璃化冷冻需要逐份手工操作，该优势减弱，但如果工作人员操作熟练，同样也可以在较短时间内完成。
3.应用范围
从目前发表文献看，玻璃化法冷冻适合所有期别胚胎和卵母细胞的冷冻保存，但是对于精子的玻璃化冷冻保存，支持的文献不多。
4.复苏率存活高
对于卵母细胞、分裂期胚胎和囊胚，玻璃化冷冻的复苏存活率均显著优于程序冷冻。对于卵母细胞和囊胚的冷冻保存，早已有很多文献指出玻璃化冷冻的优势，而对于分裂期胚胎，近年来也是有利于玻璃化的文章越来越多。
（四）玻璃化法冷冻的不足
1.技术要求稍高
与程序冷冻相比，玻璃化冷冻需要更短的操作时间和更熟练的操作技术。因此需要进行相应的培训和考核，人员必须在确切掌握了操作技术后才能用于临床实际工作。
2.安全性的随访数据较少
由于玻璃化冷冻采用的冷冻保护剂浓度高，一直以来都有对于安全性的顾虑，而目前由于在人类胚胎的应用时间较短，随访数据还比较少。近些年在国内出生的婴儿数量明显增加，还未有出生缺陷增多的报道。
3.载体问题
如前所述，玻璃化冷冻采用的载体包括开放载体和封闭载体，开放载体存在污染风险，封闭载体操作时间增加，对技术要求更高。其中多数载体的价格均较高。目前市场上存在多种载体的原因正是因为还没有一种载体能够在操作简便性、安全性、费用等诸多方面达到最佳，这也限制了玻璃化技术的应用。
（孙园园）