基于PCR的胚胎植入前遗传学诊断技术
（一）基于PCR扩增的PGD技术的步骤
基于PCR扩增的PGD技术的流程包括实验方案的设计、基因组和单细胞水平预实验、临床前预实验和临床PGD实验。在进行单细胞水平实验前，我们应该在gDNA水平上对患者、携带者和正常对照进行对应实验方案的检测，以保证从实验结果能明显区分患者、携带者和正常人。基因组和单细胞水平预实验则优化实验条件，稳定扩张效率，降低等位基因脱扣（ADO）。临床前预实验用以保证运用于临床PGD的各种耗材和试剂的有效性和可靠性。临床PGD实验所用的试剂应该与临床前预实验所用试剂为同一套试剂。临床PGD实验包括以下实验步骤：
1.胚胎活检。
2.单细胞的裂解常用的细胞裂解方法有两种，一种为碱裂解法（KOH∶DTT＝1∶1），另一种为蛋白酶K裂解法（1%Tween200.5μL，1%trion～1000.5μL，ddH2O 3μL，PCR 扩增 Buffer1μL，20 mg/mL的蛋白酶K 0.05μL）。碱裂解法的裂解程序为：65℃，2 min。蛋白酶K裂解法的裂解程序为：42℃，20 min；95℃，15 min。
3.PCR扩增，将配好的PCR扩增混合液直接加入装有裂解的细胞的PCR管中，离心后在PCR扩增仪上运行相应的PCR扩增程序。
4.扩增产物的遗传学分析：将PCR扩增得到的产物进行相应的处理，如限制性内切酶酶切分析、测序分析、电泳分析等。
5.实验结果分析和诊断报告的签发、送达 PGD实验结果应该由2个不同的实验人员给出结论，如果出现不一致的情况则需要第3个实验人员进行判断，不能给出明确结论的胚胎不能进行移植。PGD实验结果和报告单应该由具有资质的人员进行审核和签发。纸质或电子版报告应当仔细检查，然后移交给IVF实验室相应的工作人员，以确保胚胎移植的正确性。
6.PGD监测及随访
（1）随访：PGD实验室和IVF实验室应该尽自己最大的努力去调查做过产前检查和经过PGD出生的小孩的健康状况，特别要统计误诊的情况。
（2）数据分析：分析随访的胎儿情况，分娩情况，及小孩出生的健康状况应该和PGD周期数据。
（二）质量控制
1.PGD实验室需求的基础设施、实验设备和耗材
（1）需要独立的单细胞扩增前加样实验室（最好为正压室）、单细胞扩增实验室（最后为负压室）和扩增后分析室，及胚胎活检实验室。
（2）确保单细胞扩增前加样实验室和单细胞扩增实验室洁净，避免污染。
（3）单细胞扩增前加样操作应该在超净工作台上操作。
（4）如果要进行第二轮PCR，那么第二轮PCR加样的操作也应该在超净工作台上，且该区域应该与第一轮PCR区域分开。
（5）PGD的每个流程中都应该具有其专用的器材和设备，扩增所有的试剂和耗材应该远离一切DNA污染源。
（6）所有的仪器设备需要满足临床的运用标准，注意仪器的维护和保养，并且所有的操作应该符合标准程序。
（7）进入单细胞加样实验室应该佩戴隔离衣物，包括隔离衣、裤、一次性口罩、一次性帽子和一次性手套。并且每次进出单细胞加样实验室都应该更换新的隔离衣物，定期对隔离衣物进行高压灭菌处理。
（8）所有的耗材，包括一次性使用吸头，都应该进行去核酸化处理。
（9）所有的试剂应该及时记录其批次，以便出现问题时追溯问题的来源。
（10）所有试剂应该是“随时可用”和“分子生物学等级”。
（11）所有试剂应该是分装一次性使用，做完一个PGD案例后应该及时丢弃。(https://www.daowen.com)
（12）PCR扩增混合液应在紫外光下进行消毒处理，以防止污染。
2.标签的规范
（1）有一套明确的标签制度是做好胚胎活检和遗传学诊断的重要基础。最好使用打印清晰、永不褪色的标签，而不要使用签字笔手写的标签。
（2）在活检及遗传学诊断过程中关键步骤的标签应该由2组PGD工作人员共同确认，以确保每个标签和细胞/胚胎一一对应。
3.活检细胞转入PCR管
1）用于PGD的PCR管应该最大限度地减少污染，每个PGD病例所有的耗材和试剂均应该放在超净工作台中进行紫外线灭菌，并且对工作区域使用DNA降解液进行擦拭。
2）防止污染的具体措施
（1）胚胎活检过程中应该避免工作人员自身的污染。
（2）大小不合适操作人员的手套可能是一个污染源。
（3）每个胚胎应该设置一个该胚胎的培养液对照，并且每个PGD病例还应该设置一个空白对照。
3）单个胚胎细胞在放到PCR管之前应该在干净的PBS缓冲液中洗至少2遍，并且尽可能地吸入少的PBS缓冲液进入PCR管。
4）如果胚胎细胞在清洗和转移过程中裂解，那么口吸管很可能被污染，应该更换新的口吸管。
5）如果单细胞扩增体系很可靠和稳定，建议活检时只从胚胎中取出1个细胞用于遗传学诊断。2008年，Goossens等已经证明活检时从8细胞期取出1个细胞比取2个细胞的胚胎妊娠率高40%。
6）细胞充分的裂解是单细胞扩增的必要条件。碱裂解法和蛋白酶K裂解法都是很好的细胞裂解方法。
4.原则
严格执行“扩增效率达到90%，等位基因脱扣率＜10%才能进入临床PGD实验”的原则。
5.设置合理的对照
对于显性遗传病而言，需要使用阳性（患者）gDNA和正常人gDNA对照；对于隐性遗传病而言，需要使用携带者和患者gDNA对照；对于所有遗传病而言，我们都需要使用胚胎的准父母或其他亲属的gDNA对照；每个胚胎都要设立一个培养液对照。为了评估试剂污染，还要设立一个空白对照。
将一些连锁标记位点和被检测的位点一起扩增可识别污染和等位基因脱扣。对于X-连锁遗传病而言，对突变位点和与突变位点连锁的标记位点的联合扩增和分析可以诊断出正常的男性和排除女性携带者。对于X-连锁遗传病，如果只对性别进行诊断，那么几个标记位点联合诊断就可以极大限度地降低污染和排除由于等位基因脱扣所引起的误诊。
6.杜绝使用稀释的gDNA来代替单细胞进行预实验
运用稀释的gDNA来代替单细胞进行预实验所得到的扩增效率和等位基因脱扣率远远优于以单细胞为DNA模板的扩增效率和等位基因脱扣率。
7.进行PGD预实验
一个方案是至少分3次扩增50管单细胞，以确保单细胞扩增效率、等位基因脱扣率的可靠性与重复性。
8.维护
每月由专业人员对PGD实验平台进行维护，确保该体系的稳定性。
（三）病例分析-脊肌萎缩症（SMA）的PGD
1.先证者（Ⅲ2）：男，1个月后婴儿不太动，无力。SMNt基因检测7、8号外显子纯合缺失。其父母（Ⅱ3、Ⅱ4）：MLPA分析为SMNt杂合缺失。
2.PGD：胚胎经活检后获得的卵裂球采用SMNt基因7号外显子引物进行单细胞PCR扩增，后经Dra I酶切后PAGE电泳检测。对13个胚胎进行PCR-RFLP分析：11个正常胚胎或携带者胚胎，1个风险胚胎。其中2号胚胎扩增失败，12、13号胚胎可能发生了等位基因脱扣。