三、冷冻保护剂
冷冻保护剂指的是所有能够在冷冻和复苏过程中保护细胞，预防或减轻冷冻损伤的化学成分。冷冻保护剂通过脱水、调整渗透压、减少细胞内冰晶的形成并促进玻璃化、稳定细胞内蛋白质、调节细胞外电解质的作用来保护细胞在冷冻复苏过程免遭损伤。
冷冻保护剂必须具有高度的水溶性，这样才能在冰晶形成的过程中，随着浓度的增加，仍然留在溶液中而不析出。另外为了保证胚胎的发育能力，冷冻保护剂必须具备胚胎毒性低的特点。但是要注意的是：如果胚胎在较高的温度下长时间暴露于高浓度的冷冻保护剂中，胚胎的代谢仍将会受到这些保护剂的不良影响。
冷冻保护剂能够帮助细胞脱水，防止细胞内冰晶形成。在细胞外液中加入冷冻保护剂后，细胞外渗透压增加，超过生理情况下的300 mOsm/L，使细胞内的水经过细胞膜渗透到细胞外；另外当细胞外液体中渗透压增加后，溶液的冰点降低，随着温度缓慢下降，细胞外形成冰晶，细胞外的渗透压进一步增加，冰点也随之改变，因此在降温过程中，细胞仍在逐步脱水。
冷冻保护剂能够减弱高渗透性环境对胚胎的伤害。当细胞暴露于高渗透压的环境时，细胞内水分逐渐渗至细胞外，其中细胞内蛋白质、RNA、DNA等生物大分子的结合水也可能脱离，冷冻保护剂可以置换水分子而维持这些生物大分子的功能。
冷冻保护剂除了在降温过程中通过提高细胞外的渗透压促进细胞的脱水；在复温过程中也有重要作用。通过在复苏液内添加适当的冷冻保护剂（通常为蔗糖），可以提高细胞外的渗透压，减少细胞内外渗透压的差距，防止复苏时水过快地进入细胞内，导致渗透性休克。
冷冻保护剂从生物化学特性上分为渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂和其他冷冻保护剂。
（一）渗透性冷冻保护剂
渗透性冷冻保护剂又名细胞内冷冻保护剂。通常为水溶性强的小分子物质，在冷冻过程中可以较快速地进入细胞内，降低细胞内外之间渗透压的差异，减缓细胞内水分渗出造成的细胞体积皱缩的程度和速度，并且能够减少冰晶的形成，还可以与细胞内生物大分子（蛋白质、DNA、RNA）结合，替代这些分子本来的结合水（水外套），避免这些生物大分子的构型发生变化。这类冷冻保护剂从化学的角度分，可分为二甲基亚砜（DMSO）和醇类（乙二醇、丙二醇和甘油）。这些有机物的共同特性是：①具有良好的水溶性；②相对分子质量小，多在63～97；③能自由穿越细胞膜，迅速渗透入细胞内；④这些化合物细胞毒性弱。需要警惕的是几乎所有渗透性冷冻保护剂均为易燃液体，在胚胎实验室内保存需要注意防火。
1.乙二醇
乙二醇（EG）分子式C2H6O2，分子量为62.07。EG是常用的渗透性冷冻保护剂，分子量最小，因而进入细胞的渗透作用也比较快。毒性小，水溶液冰点明显降低，在工业上一直作为抗冻剂，近年来成为玻璃化冷冻的首选冷冻保护剂。
2.丙二醇
丙二醇（PROH）分子式C3H8O2，分子量为76.07。与甘油或DMSO相比，浓度高时毒性比较低，而且PROH对细胞的渗透性很好，因此在胚胎冷冻过程中，可以采用比较短的平衡时间，从而进一步减少毒性作用。近年来PROH广泛应用于人类和其他动物的囊胚和早期胚胎的冷冻，被多数中心公认为胚胎程序冷冻法保存的首选冷冻保护剂。PROH对卵母细胞也有很好的渗透性，可以缩短平衡时间并减少毒性作用，近年来也被广泛应用于卵母细胞的程序冷冻过程。(https://www.daowen.com)
3.丙三醇
丙三醇（甘油）分子式C3H3O3，分子量为92.09，黏稠，在工业和医药领域有非常广泛的用途。丙三醇是人类最早发现的冷冻保护剂，曾在冷冻保护剂的研究中起到非常大的作用。丙三醇进出胚胎细胞时较DMSO和PROH慢，尤其是对于早期分裂期胚胎，渗透速度慢，冷冻效果不理想，但丙三醇能够可以成功应用于桑葚胚和囊胚的程序冷冻。在冷冻过程中，丙三醇与细胞内水分及电解质结合，维持水合蛋白结构的稳定，在精子的冷冻过程中也有良好的抗冻作用。在慢速冷冻期间，丙三醇在临界温度阶段发挥作用。但在玻璃化冷冻时，细胞内仍有较多的冰晶形成，丙三醇保护作用差。
4.二甲基亚砜
二甲基亚砜分子式为CH3O2，分子量为78.12，常温下为无色无臭的透明液体。与前面的几种醇类化合物不同，二甲基亚砜是一种含硫有机化合物，也是比较早发现的冷冻保护剂，在过去的30年中广泛用于各种细胞的冷冻。DMSO还是第一个被用于人类胚胎冷冻的冷冻保护剂。DMSO多用于分裂期胚胎，尤其是第3天的胚胎。它在许多种类的细胞冷冻中能起到保护作用。但高浓度长时间的暴露于DMSO可能对细胞产生毒性，果糖1，6-二磷酸酶的功能可能受损，另外DMSO可能与蛋白质发生不可逆性结合，因而DMSO在人类胚胎冷冻中应用已经明显减少。由于DMSO渗透速度快，目前仍用于人胚胎的玻璃化冷冻。但试验证明，DMSO对人类精液的冷冻保护效果不佳。
（二）非渗透性冷冻保护剂
非渗透性冷冻保护剂又名细胞外冷冻保护剂，指的是在冷冻复苏过程中不能渗透入细胞膜内的化学物质，只起到提高细胞外的渗透压的作用。通常使用的均为小分子糖类如单糖、双糖或三糖等。
非渗透性冷冻保护剂分子量大，因而不能穿过细胞膜，加入细胞外液后，将产生细胞膜内外的渗透压差异，水分将从细胞内渗出到细胞外。细胞因为水分被抽出而发生皱缩，细胞内水分减少，渗透压增加，冰晶的形成受到抑制。
非渗透性冷冻保护剂的另一个重要作用是复温解冻，可也预防细胞发生渗透性休克。在复温时，复苏液中通常不含渗透性冷冻保护剂，进入细胞内的冷冻保护剂需从高浓度的细胞内离开到低浓度的细胞外，使细胞恢复正常生理功能。由于水进入细胞内的速度远远大于冷冻保护剂离开细胞的速度。短期内大量的水快速返回细胞，将造成细胞体积膨胀，发生渗透性休克。如果在复苏液中加入适当浓度的非渗透性冷冻保护剂，可以使细胞外保持适当的渗透压，减缓水进入细胞膜的速度。
蔗糖、棉籽糖、葡萄糖、果糖等都曾作为非渗透性冷冻保护剂，但目前在胚胎冷冻保存中广泛使用的仅有蔗糖。
（三）其他冷冻保护剂
除了渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂之外，在冷冻复苏的液体中，还可以添加其他一些大分子物质，也能够起到维持溶液胶体渗透压，减轻细胞的物理性损伤的作用，尤其是某些大分子物质够降低胚胎透明带损伤的机会；而且大分子物质通常能够提高冷冻液的黏滞系数，利于玻璃化状态的形成，抑制冰晶的产生。由于这些大分子物质分子量巨大，摩尔浓度很低，对渗透压没有明显的影响，因此不宜将其与非渗透性冷冻保护剂归为一类。常用的此类冷冻保护剂包括白蛋白、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖酐、羟乙基淀粉等。
另外有些学者还尝试在冷冻液中加入某些有冷冻保护作用的蛋白质，如抗冻蛋白、热时蛋白等。这些大分子物质无毒，抗冻蛋白能降低溶液冰点，抑制冰核的形成，还能与细胞膜作用，保护膜的完整性，但是尚未得到广泛的应用。也有人出于保护纺锤体微管系统免遭冷冻损伤的理论，在冷冻液中加入紫杉醇，效果及应用前景也存有争议。