二、精液优化处理
精液优化处理作为辅助生殖技术（ART）一个非常重要的环节，不仅可以去除精浆、不活动精子、畸形精子、细胞碎片及其他有害的物质，而且还可以制备出含高比例的形态学正常的活动精子。理想的精子分离技术要求：①操作简易快速，价格低廉；②获得多量活动精子；③不造成精子损伤或对分离出的精子产生非生理性改变；④尽可能去除死精子及其他细胞，包括白细胞及细菌；⑤去除有毒的或其他生物活性物质或活性氧类物质（ROS）。目前，临床上常用的精子优选方法主要包括上游法、密度梯度离心法等。精子处理方法的选择取决于精液标本的质量，各种方法都有其优缺点，选择时应该根据实际情况综合考虑，以达到获得可用于ART的最佳功能的精子，从而提高受精率。
（一）精子优选分离的试剂准备
为了尽可能模拟人体生殖道的细微平衡和精确环境，通常以IVF培养液用于精液处理。该液体属于碳酸盐缓冲液，因此装有适量培养液的平皿或试管应在用前一天备好，以便有充分时间在CO2气体环境中达到平衡。
（二）常规的优化处理
1.上游法
1）洗涤-上游法：为WHO推荐的一种精液处理方法，适用于精液参数好的精液标本，主要用于人工授精的精液标本处理。
（1）试剂：商业化的Earle's、Ham'sF10或者是HTF，并添加了人血清白蛋白（HAS）。
（2）步骤：①充分混匀精液标本；②向精液中加入等体积的上述培养基；③将稀释的混悬液分装到5～10 mL离心管内；④300～500 g离心5～10 min；⑤小心去上清液，加1 mL上述培养基，小心吹打，制成混悬液；⑥再一次300～500 g离心5～10 min；⑦小心去上清液，加适量的上述培养基约0.5 mL，小心吹打，制成混悬液；⑧分层加入培养基1～2 mL，45°倾斜，37℃培养箱内静置20 min；⑨吸取上部含活性精子的液体，并测定其浓度及活力，调整备使用。
2）直接上游法：顾名思义就是利用活动精子有向上游到培养液中的能力，从而将活动精子与死精子、白细胞及杂质分开，适用于精液质量较好和“相对正常”的精液，密度＞35×109活动精子/mL，以收集快速直线运动精子和正常形态精子。在上游前精液最好不要稀释和离心，以减少对精子膜的过氧化损伤。上游法回收率依赖于精子活动力，虽然能够显著提高精子活动率、存活率、正常形态百分率、提高精子的运动速度，但缺点是运动精子回收率低。由于离心后精子细胞成团为多层细胞，使得有潜在运动能力的精子可能处在细胞团内部，从而不能达到与培养基接触的界面；并且细胞团内精子彼此间及与细胞碎片或白细胞紧密接触，后两者产生高水平的活性氧类物质ROS，可能导致精子质膜发生脂质过氧化反应，从而降低了精子功能。(https://www.daowen.com)
此方法仅适用于正常的精液标本，而不太适用于严重异常的精液或冷冻复苏的精液标本，尤其是精子密度≤20×10/mL、活动率≤40%者。
为防止精子受到氧自由基的损伤，现多数IVF中心采用洗涤方法。参考步骤如下：①将液化后的精液充分混匀后，取1～2支5 mL离心管，每管加入精液1 mL。在其上分层加入培养液2 mL。将离心管倾斜45°，置入37℃培养箱，培养上游30～90 min（时间根据精液质量来调整），避免晃动；②用无菌吸管吸取呈云雾状上层液到另一支试管，再加培养液2 mL混匀。离心300～500 g离心5 min；③弃上清液，加培养液0.3～0.5 mL，轻弹管底，让沉淀松散；④分层加入培养液1 mL，45°倾斜，37℃培养箱内静置20 min；⑤吸取上部精子悬液，分析精子密度、活力及形态，调好密度，置入37℃培养箱待授精用。
在实验室里，经常会遇见液化不全的精液。精液液化与前列腺中的蛋白水解酶及纤溶酶等促精液液化因子有关。精液液化异常多为前列腺病变所致。精液液化障碍时，机械吹打精液即可液化。糜蛋白酶也可以使精液液化，但应慎用。
2.非连续密度梯度离心法
与精子上游法相比，密度梯度离心法能更好地分离精子和其他细胞及碎片，从而回收更多形态正常的精子，并且明显增加精子的活力和体外生存能力。目前采用的密度梯度液为硅烷包被的胶体硅分子，对胚胎无毒。Percoll为聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体硅分子，可能存在潜在毒性。具有不同悬浮密度的细胞及其他类型的颗粒会慢慢沉淀至密度较高的溶液，离心将会加快其沉淀速度。因为DNA浓缩后的成熟精子密度高于80% Pure Sperm，因而成熟精子可以通过这层液体并到达离心管底部，而其他类型的细胞包括未成熟精子就会在40%或80%的液体交界面上终止沉淀。密度梯度离心法适用于正常精液标本，特别适用于那些严重少精子症、畸精子症、弱精子症或者冷冻复苏后的精液，更能提高精子的回收率。但是当精子密度很低或黏稠度非常高时，此方法也不是非常适用。
密度梯度离心也要根据不同的精液样本进行调整，特别是离心时间、离心速度、梯度体积的调整。离心速度越高，获得的活动精子和低密度分子也越多，因此，如离心速度高，则时间应缩短。梯度体积越大，滤过效果越好，但得到的精子也越少。对于严重少精的样本，采用小体积密度梯度离心，不仅可改善滤过效率也使精子回收率增加，大量碎片会干扰梯度，影响过滤效果，这样的样本应以小体积分配到多个梯度管内。
（三）处理后的再次评估
精液经上述其中的一种方法优选后，要对优选出来的精子再进行活力及形态的评估，以了解精子的情况并结合临床决定授精方式。
（林晓潭）