胚胎培养液的主要成分
胚胎培养液主要包括水、无机离子、能量底物、蛋白、维生素和生长因子等成分。
（一）培养液的水
水占培养液总体成分的99%。培养液对配制的水要求非常高。如果自制培养液，必须要有来源稳定的高纯水。水容易被多种物质污染，如杀虫剂、除草剂、工业污染等。随着季节的不同，温度发生改变时，溶解于水中的污染物也会随之改变。水中的污染源可分为四种：无机物、有机物、微粒和细菌、真菌等微生物。另外，水中经常会添加氯、氯胺、臭氧、氟和聚离子底物等。因此，配制培养液前对水的净化步骤非常重要。通常采用紫外氧化系统加Milli-Q纯水净化系统净化水，其步骤包括微粒过滤、反渗透压和去离子等，最后用0.22μm过滤器过滤以去除任何残留的物质，防止细菌污染。
IVF 实验室如果自制培养液，必须具备水的纯化设备，而且需要严格地按要求定期维护超纯水装置，如每月更换过滤装置，每21 d监测氯水平，监测水的总有机碳和二氧化硅含量等。配制培养液的水质量和纯度直接影响培养液的质量，从而影响胚胎的发育潜能。
（二）培养液的离子组成
目前用于胚胎培养的各种培养液的离子组成几乎都是基于KRB液的配伍，含有Na＋、K＋、CI、Ca2＋、Mg2＋、SO4，其中Na＋和Cl浓度最高。另外，还有许多培养液含有PO42。
在培养液的各种无机离子中，钙、镁离子和胚胎细胞的pHi相关。钙离子是所有细胞通用的调节子，钙离子异常改变蛋白质合成、DNA调节、线粒体功能如氧化代谢和细胞之间的联系。正常钙离子储存在内质网、线粒体和细胞核内，通过细胞膜或者L-偶联钙离子通道调节。胚胎操作不当，或者代谢受干扰，容易引起钙离子调节失常，造成细胞功能紊乱。通过增加培养液中镁离子浓度至2 mM，减少钙离子通过钙通道的内流是许多培养液常用的配伍。但钙离子释放形成钙振荡是受精必要的过程，因此受精液中应降低镁离子浓度至0.2 mM。
钙离子和镁是胚胎致密化的必要成分。缺乏钙和镁离子，细胞之间不能形成紧密连接。因此，在D3胚胎活检液为无钙镁的液体，使细胞之间的连接松散，利于活检的操作。
由于输卵管内的液体是从供应输卵管和子宫的动脉血中渗透而来的，而在围着床期间输卵管各个部位动脉血渗透成分应保持稳定。因此在序贯培养液中，似乎没有太大必要去改变离子成分。
Quinn-HTF培养液是较早成功应用于人类胚胎体外培养的液体。Quinn-HTF培养液无机离子浓度与M16和Whitten液类似，但钠、钾离子的比例较传统的T6培养液低4倍。降低无机离子浓度，从而降低离子渗透压对鼠胚克服2细胞阻滞非常重要。另外，磷酸的浓度明显降低。降低磷酸浓度的原因是早期胚胎有较高的ATP水平，可以作为磷酸盐的内在来源，而过高的磷酸可通过葡萄糖的磷酸化导致糖酵解的增加，及氧化反应的降低，造成能量来源的不足（Crabtree作用），这也是鼠胚2细胞阻滞的重要原因。
（三）培养液的能量底物
女性生殖道不同部位液体中的能量底物成分有所变化，如输卵管中乳酸浓度相对高，而葡萄糖浓度相对低，但宫腔液中乳酸浓度相对低，葡萄糖浓度高（乳酸浓度从10.5到5.87 mmol/L，葡萄糖浓度从0.5到3.15 mmol/L）。丙酮酸的浓度在生殖道的不同部位没有明显变化，为0.24 mmol/L。人类胚胎培养液的能量底物主要根据输卵管和宫腔内能量底物的变化而设计。
1.葡萄糖
多种动物实验表明，含有磷酸盐的简单成分培养液中添加葡萄糖会造成早期胚胎发育阻滞。在体内，卵丘细胞将葡萄糖转化为丙酮酸和乳酸，因此卵母细胞和合子与葡萄糖没有直接接触。着床前胚胎有大量的糖酵解酶。当有足够的糖和磷酸盐时，糖酵解增加，使葡萄糖转化为乳酸，影响氧化代谢，造成能量来源的不足和鼠胚的2细胞阻滞。如前所述，Quinn的HTF液除了降低镁离子和磷酸盐浓度，其葡萄糖的浓度也只有 Whitten 液和M16液的一半。另外，还可在培养液中添加EDTA，通过螯合细胞间镁离子来抑制糖酵解通路的酶克服胚胎发育阻滞。
胚胎致密化之后，糖酵解成为重要的能量产生通路。发生致密化的胚胎对葡萄糖有高度依赖性。葡萄糖参与不同的细胞生物代谢、合成及调节。葡萄糖是糖蛋白的组成成分，也是磷脂及甘油合成的重要前体。曾有研究表明致密化胚胎至囊胚期的葡萄糖消耗量可作为评估囊胚发育潜能的指标。因此在囊胚液中需要增加葡萄糖的浓度，并且需要去除EDTA。同期，在子宫腔内，氧浓度也进一步降低，以限制氧化磷酸化提供能量的方式。
与早期胚胎培养液不同，精子洗涤液和受精液一般含有较高浓度的葡萄糖，因为精子需要摄取葡萄糖来提供能量。
2.丙酮酸和乳酸
在卵裂期胚胎中，丙酮酸是早期胚胎发育最关键的能量来源。培养液中丙酮酸缺乏会使人类胚胎在8细胞期发生发育阻滞。在小鼠胚胎中丙酮酸支持受精卵发育到2细胞胚胎，而乳酸则可作为2细胞后胚胎能量来源。乳酸作为能量物质，与丙酮酸有着协同的作用。适当的细胞内乳酸/丙酮酸比例可平衡胞质内NAD＋/NADH比例。这些研究是现用在小鼠胚胎培养的经典培养液M16的研究基础。目前，培养液中一般添加有生物活性的左旋-乳酸。在囊胚期，葡萄糖则是更重要的能量来源。
（四）氨基酸(https://www.daowen.com)
氨基酸在早期胚胎发育中的作用是多方面的，包括作为生物合成前体，提供能量来源，调节渗透压，调节细胞内pH，抗氧化剂，螯合剂，及调节分化。20世纪80年代的培养液HTF中并未添加氨基酸，但在90年代更多的研究强调氨基酸在早期胚胎发育中的作用，继而所有的商业化供应的培养液中均含有氨基酸。在人类输卵管液中含有氨基酸，而卵母细胞、早期胚胎均有内源性氨基酸库和特殊氨基酸转运系统。培养液中添加氨基酸可以避免胚胎内源性的氨基酸外流。更重要的是，氨基酸可作为有机渗透压调节因子，在不影响细胞正常功能的前提下调节细胞内的渗透压。当无机离子浓度的升高导致细胞内大分子如酶活性受干扰时，通过培养液中添加氨基酸可保护大分子的重要功能不受影响。
氨基酸的浓度及具体组成仍有争议。一般认为，输卵管内有高浓度的非必需氨基酸和低浓度的必需氨基酸。非必需氨基酸刺激早期胚胎分裂、滋养外胚层细胞有丝分裂率和囊腔的形成。必需氨基酸在胚胎致密化之前对早期胚胎有抑制作用，但在致密化之后，必需氨基酸刺激分裂率和内细胞团的形成。
从D2到囊胚期，人类胚胎均摄取亮氨酸，而在后期，胚胎摄取丝氨酸、精氨酸和其他必需氨基酸增多。胚胎一直分泌的氨基酸有丙氨酸和谷氨酸。人类胚胎培养液中最好不含有丙氨酸。因为胚胎转氨酶持续作用可将丙酮酸被转化为丙氨酸，有利于通过转氨酶除去对胚胎自身有毒性作用的氨。而培养液中添加丙氨酸则减弱转氨酶的持续作用。另外，谷氨酸是胚胎的谷氨酸合成酶的产物，并可同时产生氨。因此，目前培养液中选择更稳定的二肽谷氨酰胺，减少培养液中氨的累积。
（五）维生素
维生素是调节细胞代谢过程的生物活性物质，但其在细胞培养方面的作用还有待于进一步证实。在动物实验中证实维生素可以刺激或维持胚胎的正常发育。随后，在人类早期IVF中使用的Ham's F10和Eagle's MEM 培养液均添加了维生素，特别是MEM中添加了8种维生素，但很快被减为仅有泛素或泛素再加其他3种维生素。维生素与氨基酸有协同作用，可阻止代谢干扰和不良培养条件对胚胎发育潜能的影响。
（六）激素和生长因子
1.激素
一般在未成熟卵体外培养液中添加激素，如促卵泡素、黄体生成素、人绒毛膜促性腺激素和胰岛素等，以提高卵母细胞体外成熟率和发育潜能。
2.生长因子
人类输卵管液体中含有多种肽类生长因子，胚胎则有许多因子的受体，而且胚胎自身也分泌多种生长因子。现已证实生长因子粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）增加临床妊娠率，并且不增加流产率和新生儿畸形率。2012年Kawamura等在无血清培养液中添加重要生长因子（脑源性神经营养因子，集落刺激因子，表皮生长因子，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，胰岛素样生长因子-1，胶质细胞源性神经营养因子，及青蒿琥酯），将人类三原核合子的囊胚率增加2.5倍，正常受精6～8细胞期胚胎的囊胚率增加超过3倍，优质囊胚率增加超过7倍。生长因子对卵裂期胚胎的影响可能不如囊胚形成阶段明显，因此在囊胚培养时选择成组培养的效果可能优于单独培养。
（七）蛋白
体内的着床前胚胎暴露于卵泡、输卵管和子宫内的各种生长因子、旁分泌和自分泌因子中，这也是体外培养时难以完全模拟的。从20世纪80年代开始，各种蛋白如小牛血清、人类脐血血清和母血血清等开始添加于培养液中。培养液中添加蛋白的作用包括通过结合脂肪酸抑制脂肪的过氧化反应，从而稳定和保护细胞膜；结合各种抗体、重金属、脂蛋白和未明确的毒性物质；维持胶体渗透压的稳定；为囊胚发育提供必要和直接的营养物质。实际操作中，添加蛋白可以防止胚胎互相黏附或粘在培养皿的表面，胚胎活检时添加蛋白可以减低活检细胞的膜破裂溶解概率。
在早期添加的各种蛋白的不同批次之间明显缺乏一致性，某些批次甚至存在胚胎毒性，或传染疾病的风险。目前人类胚胎培养液中最多添加的蛋白是人类血清白蛋白（HSA），其次是各种球蛋白制品包括合成血清替代品（SSS）、SPS（SAGE）和LGPS（Life Global）等，如SSS是84%人血清白蛋白和16%α和β-球蛋白的混合物。
值得注意的是，尽管目前生产蛋白的纯化技术较以前有明显提高，但从血清中提纯蛋白仍不能保证其成分的稳定性。如SSS较HSA有更多低分子蛋白，特别是在10～37 kDa范围。对这些低分子蛋白进一步分析，提示含有多种细胞激酶、生长因子和载体蛋白，如黄体酮、FSH、TSH、DHEA-S、HCG，及胰岛素、VEGF和IGF-Ⅱ等。
因此，培养液中添加的蛋白仍存在批次的差异，同一生产商生产的每一批次的蛋白都是唯一的，可能含有批次特异的、有潜在毒性的激素和蛋白污染物。同时，为了保持白蛋白在灭菌后的构造和可溶性，经美国FDA许可，所有的HSA均会添加蛋白稳定剂，如辛酸钠和乙酰色氨酸酯钠。另外，还会添加马来酸作为防腐剂。在培养液中，蛋白添加的比例最高到20%，因此过多蛋白稳定剂进入培养体系也可能会成为影响胚胎发育的重要原因。
另外一个添加蛋白时常见而又容易被忽略的问题是内毒素。内毒素可能在培养液中漂浮，或者结合到添加的蛋白上。脂多糖内毒素分子仅50 kDa，但有热稳定性，不容易通过常规灭菌和过滤的方法去除。内毒素浓度高于0.1 EU/mL已经可以影响胚胎体外发育，增加胚胎碎片量，但0.02 EU/mL的内毒素不会明显影响胚胎体外发育，可能导致难以解释的活产率下降。
由此可见，培养液中添加的蛋白受供血的血源、生产过程、纯化技术、蛋白稳定剂和防腐剂，及隐性内毒素等的影响。因此蛋白是培养体系中最容易产生批次差异，从而影响IVF的妊娠结局的因素。从受精到卵裂期胚胎，似乎简单的培养系统也可以获得健康的后代，但从卵裂期到囊胚阶段胚胎需要各种营养物质，才能获得有发育潜能的囊胚。目前其他简单成分的大分子如透明质酸、聚乙烯醇（PVA）和聚乙烯醇等还不能替代蛋白在囊胚培养中的作用。
（八）抗生素
培养液中常规添加抗生素以减少污染的机会。青霉素和庆大霉素是培养液中最常添加的抗生素，但也有培养液添加青霉素和链霉素。青霉素是β-内酰胺类中一大类抗生素的总称。β-内酰胺类作用于细菌的细胞壁，干扰细胞壁中糖蛋白的合成而抑制细菌细胞壁的形97成。由于人类只有细胞膜无细胞壁，故对人类的毒性较小，除能引起严重的变态反应外，在一般用量下，其毒性不甚明显，但它不能耐受耐药菌株（如耐药金葡）所产生的酶，易被其破坏，且其抗菌谱较窄，主要对革兰阳性菌有效。庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，能与细菌核糖体30S亚基结合，阻断细菌蛋白质合成。庆大霉素主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰阴性菌引起的感染。庆大霉素比青霉素更能有效杀死和抑制精液中的细菌，而且庆大霉素也是为数不多的热稳定性的抗生素，因而被广泛应用于培养基配制。