冷冻复苏过程中的损伤
（一）冰晶
1.发生原因
胚胎冷冻复苏过程中产生的冰晶是最重要的冷冻损伤。随着温度下降时，细胞内的水会在温度降至冰点以下而结冰，形成细胞内冰晶。微小的细胞冰晶对细胞没有明显的损伤作用，但如果形成大的细胞内冰晶，冰晶越大，造成的损伤也越大。这些大冰晶由于机械作用损伤细胞膜及其他的细胞器的膜性结构，并挤压细胞内部的各种细胞器和细胞骨架。这些机械性损伤会使细胞造成致命性伤害，甚至导致细胞死亡。由于细胞内外溶液中含有离子或溶质，那么溶液的冰点（开始出现冰晶的温度）将低于0℃。冰点取决于溶质的浓度。当含有溶解质的水溶液开始降温时，将在细胞外形成结晶，冰晶内为纯水，剩余的溶液中水分减少增加了电解质的浓度，这样更进一步降低了剩余水溶液的冰点。所以在培养液中和细胞内部，冰晶的形成是随着温度的下降逐步出现的，而不是整体同时结冰。
如果不采用适当的冷冻方法，随着温度下降，细胞的死亡通常发生在温度下降到-15～-60℃的温度段内，而这正是冰晶开始形成的温度。无论在冷冻或复苏过程中，当细胞经过这一阶段时都是非常危险的。
细胞内含水量降低，可以减少冰晶的形成。因此各种冷冻方案中都努力降低细胞内的水含量，但细胞内过度脱水对细胞是有害的。由于过度脱水会导致细胞内结构的异常，而且蛋白质、核酸等大分子物质均含有大量的结合水，这些结合水如果也从分子上脱离，会导致大分子功能异常。
2.预防措施
为了减少细胞内冰晶的形成，可以增加细胞外溶液的浓度。这样，在冷冻过程中，随着降温过程中温度的下降，到溶液的冰点以下时，细胞外溶液首先形成部分冰晶。由于冰晶内不含溶质，细胞外溶液由于结冰而使剩下的水中溶质的浓度升高。细胞内的过冷溶液的渗透压将低于细胞外溶液的渗透压。如果降温速度快，超过了水渗透出细胞膜的渗透速度，细胞内的水不能及时渗出而在细胞内形成冰晶。但是如果适当的控制降温速度，使细胞内的水就有充足的时间透过细胞膜渗透到细胞外液中，将使细胞内进一步脱水，渗透压提高而冰点下降。
（二）重结晶
1.发生原因
发生原因指的是冷冻的细胞在复温的过程中形成冰晶的情况。当细胞非常快速降温冷冻时，细胞内的水如果来不及渗出到细胞外，就会在细胞内形成冰晶。冷冻的速度越快，生成的冰晶越小。细胞内生成非常小的冰晶不会危害细胞的功能。但是，在冰点下的一定温度范围内，水的结晶状态和液体状态之间存在动态平衡。当细胞的温度上升至一定的温度段时（通常复温至-100℃以上），如果复温速度过缓，细胞内原来存在的细小冰晶可以重新将周围的液态水吸附至其表面，导致结晶体积增大，也就是说冰晶在这种情况下会不断生长。细小冰晶增大为大冰晶的过程常常与复温速度有关。重结晶在-100℃时进行得很慢，但在-50℃以上时就进行得较快。因此，在复温过程中，缓慢解冻时往往会由于重结晶而造成细胞死亡。
2.预防措施
在冷冻过程中尽量减少冰晶形成的机会。复温时迅速升温可使发生重结晶的小晶体数目减到最少，同时由于减少了细胞处在高浓度溶质中的时间，也能降低溶质效应。目前几乎所有冷冻复苏方案中，复苏均采用快速复温的方法。
（三）溶质效应
1.发生原因
细胞外水溶液渗透压的提高，会对细胞造成一定的损伤，即所谓的“溶质效应”。细胞膜是一种生物半透膜。如果细胞膜内外渗透压存在差别，水将从渗透压低的一侧流向渗透压高的一侧，以使膜内外渗透压保持平衡。
如前所述，为了减少冰晶损害，通常采用较高浓度的细胞外溶液，而且缓慢降温。在降温过程中，随着温度的不断下降，溶液中的水逐渐形成冰晶，使溶液中的水分减少，溶质浓缩，渗透压升高，将致使胚胎内的细胞暴露于渗透压越来越高的环境中；而且随着细胞外离子浓度的增高、渗透压的增高，溶液的其他一些物理化学参数如气体溶解度、黏滞度和pH等也会发生改变，偏离细胞通常的生理环境，这些情况的改变将加重细胞的受损程度。
2.预防措施
为了减少溶质效应，在减少冰晶形成的基础上，尽量降低细胞外溶质的渗透压，并减少胚胎在高浓度液体中的暴露时间，冷冻复苏胚胎细胞才会得到更高的复苏率。
（四）破碎损害
1.发生原因
由于冰的密度小于水，水形成冰晶后体积增加，因此在水溶液中，随着温度下降到冰点以下，伴随着冰晶的出现，会使冰水混合物的总体积增加，而大多数冷冻容器在温度降低的过程中容积会有微弱的减小。因而在容器内的细胞可能受到增加的压力的作用，导致结构受到机械性的损害，主要在-130℃时发生。
2.预防措施(https://www.daowen.com)
采用开放容器或较软质地的容器可能会减少破碎损害。但由于开放容器有污染风险，采用的中心有逐步减少的趋势。由于玻璃化冷冻的过程中溶液没有冰晶形成，因而体积变化很小，破碎损害不明显。
（五）渗透性休克
1.发生原因
细胞在冷冻前经过了高浓度溶液的脱水阶段，经过这样的处理后进行降温。降温过程中，由于细胞外液冰晶形成，导致细胞内渗透压更高，可达2000～3000 mOsm/L。如果将胚胎直接置于相当于人体组织液渗透压的等渗培养液中，必然导致细胞外的水分快速进入细胞，而细胞内冷冻保护剂渗透速度远比不上水进入的速度，将造成细胞体积急剧增大甚至破裂，这种损伤称为渗透性休克。也就是说，渗透性休克发生在冷冻胚胎复温时。
2.预防措施
在复苏过程中，将细胞内部为高渗透压的胚胎放入含有一定浓度细胞外冷冻保护剂的较高渗透压的培养液中，使细胞内外渗透压的差距减小，细胞体积变化减缓，可以避免细胞体积的剧烈变化。但要注意，延长复苏时间，使胚胎在高浓度的培养液中时间过长，会加剧溶质效应的损害。
（六）冷休克
温度降低对哺乳动物的细胞也存在一定的直接效应，叫作冷休克损伤，或者叫“寒冷损伤”。冷休克是温度下降对细胞结构和功能造成的损伤。冷休克的发生与细胞膜蛋白质和细胞骨架在低温下发生的改变可能有关。这种损伤有细胞和种属特异性，在人类精子和胚胎的冷冻过程中，这种损伤并不突出。而在许多其他哺乳动物的精子冷冻或在人卵母细胞冷冻、卵巢或睾丸组织冷冻中，这种损伤造成的影响比较突出。
（七）胚胎冷冻损伤的评估
胚胎的冷冻损伤可以从三个方面来评价：形态学变化、胚胎发育能力和着床的能力。
1.形态学
复苏后，评价胚胎的形态学特征最直接快速，是目前判断胚胎存活与否的主要手段。
（1）分裂期胚胎：细胞存活的标准是细胞大小正常，细胞膜清晰，胞质折光性正常，没有发生细胞解体、固缩、过度膨胀等情况。对于整个胚胎来说，有半数或半数以上的胚胎内细胞存活可以认为是该胚胎存活。另外还需要注意透明带是否完整。根据存活卵裂球数目的多少，可以将分裂期胚胎的存活状况可分为完整性存活和部分性存活。完整性存活是指解冻后胚胎内所有的卵裂球均存活，没有任何一个卵裂球受到冷冻损伤而死亡，这是最理想的冷冻效果。而部分性的存活是指解冻后，胚胎内有一个或多个卵裂球因冷冻损伤而死亡，造成胚胎内的卵裂球数目的低于冷冻前的数目，但存活细胞超过半数。
（2）囊胚：囊胚的存活从形态上判断也需要注意囊胚内各个细胞的细胞膜、折光性及透明带的完整性，但对囊胚来讲，是否存活更准确的判断标准要依赖于发育能力的判断。
2.胚胎发育能力
胚胎发育能力的观察，比形态学判断更为确切，但需要一定的时间。
（1）分裂期胚胎：分裂期胚胎解冻后，继续在体外培养一定时间，通常过夜（12 h以上）后，存活的胚胎细胞数能够增加，或者发生细胞间融合。
（2）囊胚：囊胚解冻后，存活的囊胚经过较短时间的培养，就能观察到囊胚腔重新扩张。根据北京协和医院的经验，复苏后的囊胚，最早的在15 min就可以看到囊胚腔增大的迹象，1 h后几乎所有存活囊胚均可以见到囊胚腔扩张，2 h后囊胚腔将基本充满透明带内，培养12 h后，85%的囊胚能够孵出，并可以发现细胞数明显增加。因此囊胚冷冻复苏后比分裂期胚胎能更快地判断发育能力。
3.着床的能力
判断冷冻复苏过程中胚胎着床能力是否造成损伤，最有临床意义的是临床结局。但是由于胚胎着床除了受到冷冻复苏的影响外，还受到内膜准备方案、移植技术等多方面的影响，因此采用种植率难以分析冷冻复苏方案的具体步骤，仅供宏观参考。
已经有文献证实，解冻后胚胎丢失的卵裂球数目越多，胚胎的着床能力越低。完整性存活胚胎的着床能力明显高于部分性存活的胚胎，完整性存活的冷冻胚胎的着床能力与相同形态学评分的新鲜胚胎的着床能力相近似。