分裂期胚胎玻璃化冷冻复苏
本方案使用的冷冻载体为冷冻环，实际操作时，需要用一个一端带有磁铁的金属棍棒吸住冷冻管的盖，就可以在液氮下操纵盖子旋入或旋出冷冻管。
（一）冷冻
1.器材
电子天平、移液泵、液氮容器、磁铁棒、止血钳。
2.耗材
15 mL离心管、巴氏吸管、无菌手套、60 mm内外池培养皿、铝制冷冻管架、冷冻环、0.22μm滤器、10 mL注射器、四孔板。
3.配制预备液
7个15 mL离心管，分别写上A，B，C，D，E。
（1）HEPES缓冲地含蛋白HTF培养液10 mL。
（2）A＋蔗糖3.4 g。
（3）B+Ficoll 0.1 g。
（4）二甲基亚砜4 mL。
（5）乙二醇4 mL。
（3）～（5）分别用0.22μm滤器过滤除菌。
4.玻璃化冷冻
1）取出4孔板，按下面方法加液体。
（1）1号孔加入A液850μL。
（2）2号孔加入A液850μL。
（3）3号孔加入C700μL。
（4）2号孔加入D75μL，3号加入D150μL。
（5）2号孔加入E75μL，3号加入E150μL。
（6）2号和3号孔充分混匀。
2）在37度超净台上平衡15 min。
3）冷冻管上写患者姓名、病历号、日期。
4）用磁棒旋下冷冻管盖子。(https://www.daowen.com)
5）从培养箱取出含胚胎的培养皿，核对姓名后将胚胎转移入孔1，平衡1～2 min。
6）胚胎转移至2号孔中，平衡2 min，轻柔吹吸数次。约剩1 min时，用移液管将3号孔内液体再次混匀后，从中取少量冷冻保护剂，在另一个空培养皿内做3个50μL左右的液滴。
7）到2 min，将胚胎取出，置入步骤7制备的液滴1中；将胚胎转移至液滴2，反复吹吸混匀；20秒时将胚胎吸入巴氏吸管并停留在最尖端。左手持磁棒，在肉眼观察下，将冷冻环在液滴3中蘸一下，显微镜下将胚胎小心转移至冷冻环上。从胚胎进入3至进入液氮不宜超过30秒，不短于25秒。
8）迅速将冷冻环浸入液氮中。
9）在液氮中将冷冻环旋到冷冻管上，取下磁棒。检查巴氏吸管和液滴，是否有遗漏胚胎。将冷冻支架放入液氮罐相应的提篮中。
10）填写冷冻记录。
（二）复苏
1.器皿与液体准备
1）取出上述预备液A、B。
2）取5个1 mL培养皿，分别写上1，2，3，4，5。按以下配液。
（1）2号加入A400μL。
（2）3号加入A800μL。
（3）4号加入A800μL。
（4）5号加入A 800μL。
（5）1号加入B 800μL。
（6）2号加入B800μL。
（7）3号加入B400μL。
（8）4号加入A200μL。
3）各培养皿内覆盖培养用油0.8 mL。
4）超净台上37°下平衡15 min。
2.复温与脱冷冻保护剂
（1）在液氮中，用磁棒小心旋下冷冻环，空气中略停顿3～5秒。
（2）冷冻环浸入培养皿1，计时1 min，轻柔吹吸数次。
（3）依次将胚胎转移入培养皿2（停留1 min）、培养皿3（停留2 min）、培养皿4（停留3 min）和培养皿5（停留5 min）。其间轻柔吹吸数次。
（4）2 h后移植或转移入含囊胚培养液的液滴中培养过夜后移植。