玻璃化冷冻容器

二、玻璃化冷冻容器

在玻璃化冷冻的方案中,为了实现理想的玻璃化状态,需要加快降温的速率,减小冷冻体积。而玻璃化冷冻中的冷冻容器是实现小体积的关键。

根据胚胎是否可能直接接触液氮,冷冻载体分为开放式载体或封闭载体。

(一)开放性载体

开放性载体上的胚胎及其周围的冷冻液能直接接触到液氮。开放式载体使用中,含胚胎的冷冻液与液氮可以直接接触,降温速度更快,易于实现玻璃化,但是存在污染的风险。我们日常使用的液氮是通过对空气高压压缩分馏而来,液氮本身不是无菌的,而空气中、液氮罐内或冷冻容器表面的一些微生物可以一直“冷冻”保存在液氮中,可以经过液氮传播到其他冷冻标本。另外,某些病毒性疾病(如乙型肝炎、丙型肝炎或艾滋病)患者的胚胎会存在病毒污染,这些病毒可能经过液氮污染其他患者的胚胎。虽然这种风险目前只是理论性的,还没有病例报道,但污染风险仍是开放性载体的致命缺陷。

1.冷冻环

1999年Lane等首次报道冷冻环,该产品设计之初是用于结晶学的研究,并非用于胚胎冷冻。冷冻环是用细尼龙丝制成的直径约2 mm的尼龙环,安装在一小段空心金属杆上。尼龙环浸入培养液后,由于表面张力的作用,在尼龙环上可以形成一个液体薄膜,可以将胚胎直接放在液体膜上,浸入液氮。冷冻环的液体量较小(<1μL),与液氮接触的相对面积更大,可以达到更高的冷冻速率。冷冻环的操作比较简便。由于结构稍显复杂,需要防止使用过程中尼龙环或金属杆脱落。

2.J.Y.麦管

J.Y.麦管是手持的麦管载杆与放置胚胎的勺状薄片为一体化制成,冷冻载体的封套底端有金属配重,便于操作中保持麦管直立,也可以防止在液氮内漂浮。

3.Cryotop(https://www.daowen.com)

Cryotop 是一个非常薄而窄的片状膜,连接一个可以手持的杆,将胚胎和冷冻液的小微滴放在薄膜的顶端后浸入液氮。国内有的中心采用麦管自制成类似Cryotop形状的载体,也得到了非常好的复苏率,而且大幅度降低了费用。

4.Cryotip、Cryoleaf

这几种产品的外观和使用方法与J.Y.麦管和Cryotop类似。

(二)封闭性载体

封闭性载体的使用,是在标本封装后再行玻璃化冷冻,或者是通过不接触液氮的方式实现了玻璃化冷冻后再封装,因此从根本上杜绝了污染的风险。但是由于需要封装的过程,可能会延长胚胎在玻璃化液体内的操作时间,所以对操作要求更高。

1.拉细麦管是将通常用于程序化冷冻的0.25 mL的麦管经过加热后拉成内径120μm左右的细管,冷冻时将胚胎吸入拉细麦管的细段后,采用热封的方式封闭后再投入液氮。由于麦管很细,管壁经过拉伸后又非常薄,所以即使隔着管壁,降温速率仍能达到每分钟16 700℃以上。

最近有公司生产成品化的拉细麦管,或石英玻璃制成的毛细管,原理相同,降温速度更快,缺点是费用较贵。

2.冷冻钩是一个高分子材料制成的小钩状载体,该产品配套销售有导热性极佳的金属块。先将金属块下半部分浸入液氮冷却,将胚胎液滴放在小钩末端后,将小钩放在金属块顶端表面冷却,然后再放入套管封装。因为金属块表面可以消毒,所以可以认为是封闭性载体。