卵母细胞体外培养
（一）培养液组成
1.能量物质
不同哺乳动物所用的最适宜培养液不同。如小鼠胚胎培养通常用CZB，猪胚胎多用NCSU23，牛、绵羊胚胎多用SOF。这些培养液有一个共同的特点，即不含葡萄糖。小鼠、绵羊、牛和人的早期胚胎在致密化前主要以丙酮酸、乳酸和氨基酸为能量底物，而致密化后的胚胎则对葡萄糖的摄入和利用增加，在无氨基酸的条件培养液中，葡萄糖诱导细胞的呼吸抑制，从而导致ATP产量下降，乳酸/氨基酸介导的发育程序抑制，进而抑制胚胎的早期卵裂。
2.氨基酸
培养液中添加氨基酸能够克服胚胎早期的发育阻滞，促进胚胎的发育，增强其种植后的发育能力，其作用的可能机制主要是调节胚胎的能量代谢，抑制糖分解活性，从而降低糖对早期胚胎的有害影响，调解渗透压，谷氨酰胺主要作为能量利用。
3.生长因子
体外培养液中添加IGF-Ⅰ能抑制细胞凋亡，促进细胞增生，有利于胚胎的发育。EGF能促进卵泡的发育，增加蛋白质的合成和囊胚的孵化。细胞因子主要是白细胞介素家族的成员，在体外培养液中添加促纤维生长因子和促上皮生长因子能促进牛胚胎的发育。
4.抗氧化物
胚胎代谢过程中产生的过氧化物能改变细胞内的一些分子，阻止或延迟胚胎的发育。胚胎主要有两类抗氧化机制，即胞外抗氧化机制和胞内抗氧化机制。胞外抗氧化机制主要由卵泡或生殖道内的次牛黄酸、牛黄酸和维生素等物质操纵。胞内抗氧化机制主要由一些酶来操纵，如过氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等，通过这些抗氧化物分解胚胎代谢过程中所产生的过氧化物，维持胚胎的正常发育。
5.蛋白质
胚胎培养液中常用的蛋白质主要是血清。其组成成分复杂，包括生长因子、激素、维生素、矿物质和细胞因子等。血清的作用主要是维持细胞的存活，促进生长、维持细胞pH和渗透压、增加细胞弹性及膜的完整性等。
（二）卵母细胞体外培养的影响因素
不同物种的卵母细胞在体外的成熟时间、成熟能力及体外成熟的表现具有差异，同一物种不同发育阶段的卵母细胞也不相同。其根本原因在于卵母细胞自身结构的区别，包括卵丘细胞的多少、胞质内细胞器的分布和数量、膜的成熟状态等。此外，卵母细胞体外成熟要求的条件也不同，如温度、湿度、培养基、气相及激素水平等。在进行卵母细胞体外成熟时，要清楚卵母细胞在体内所处的环境条件和特殊性，如动物年龄及卵巢状态。同一种动物在不同年龄阶段其卵母细胞体外成熟的情况也有所不同，表现在蛋白质合成、能量代谢等模式均有区别。
人卵母细胞减数分裂的纺锤体对于胞质和周围环境的改变非常敏感，尤其是温度。一般来说，体外受精实验室常规工作中涉及胚胎的操作过程都要求保持37℃恒温。但日常实验室工作中常常会出现胚胎暴露在室温的情况，如胚胎的传递过程中，胚胎实验室的室温保持在23～25℃。Simerly等研究了在离体条件下，温度对人卵母细胞的影响。研究发现，当温度冷却至室温仅10 min，培养基中的人卵母细胞就发生变化，或纺锤体变小，或纺锤体内微管解体甚至完全消失，中期染色体也呈无序分布。将室温放置10 min或30 min的人卵母细胞再次放回37℃培养箱中1或4 h，不到一半的卵母细胞恢复至与未受降温处理的对照卵母细胞相似。由于纺锤体在细胞分裂中作用至关重要，可能与人早期胚胎中非整倍体的发生有关，所以在取卵及卵母细胞体外操作过程中，且要保持温度为37℃。Combelles等报道，温度降至25℃仅10 min，人卵母细胞减数分裂纺锤体的损伤就会不可逆的。Almeida等研究了18个人卵母细胞，发现在室温下10 min有72%的卵母细胞发生纺锤体断裂，56%发生染色体的解聚分离，复温之后损伤也不能恢复。(https://www.daowen.com)
（三）OCCC成熟度判断
OCCC回收后，需要对其进行判断以了解卵母细胞的成熟情况及决定授精前卵母细胞的培养时间。OCCC分期及卵母细胞成熟度分级
1.Ⅰ期
即前期Ⅰ，这是最为不成熟的时期，无第一极体，周围细胞紧紧包裹着卵丘细胞，没有任何松散。有时可以看见一个大核即所谓GⅤ期卵母细胞，透明带看不清，体外培养需要24 h以上，且成熟率很低。
2.Ⅱ期
即前期Ⅰ与中期Ⅱ之间，生发泡消失，但无第一极体（MⅠ期卵母细胞），外周大量卵丘细胞紧紧包裹，一层紧密的放射冠细胞围绕卵母细胞，分散，透明带看不清，需要培养6～12 h。
3.Ⅲ期
即中期Ⅲ，可见第一极体排出（MⅢ期卵母细胞），这是最常见和最易授精成功的成熟卵母细胞，放射冠细胞呈放射状排列，卵丘细胞散，呈松散状，透明带清晰看见。
4.Ⅳ期
即中期Ⅱ，仍可见第一极体，放射冠细胞常聚堆或不完整，卵丘细胞大量分散，常易脱落，仍然有细胞结构，透明带清楚可见。
5.Ⅴ期
卵母细胞色泽暗淡，有时难以找到，卵丘细胞已经分散，这种卵母细胞难以授精成功。
应当注意，在OCCC判断不甚准确。一者为避免对卵母细胞不必要的损伤使观察时间短促，再者是对卵母细胞的观察易受到颗粒细胞的影响，在工作中OCCC成熟观察以颗粒细胞形态为主。有研究表明，OCCC的颗粒细胞表现与卵母细胞的减数分裂成熟进程不完全一致，工作中OCCC的评级是只供参考的粗略判断。
（孙园园）