三、常规体外受精
（一）卵母细胞的体外成熟培养
IVF-ET中，取卵是在自然排卵前进行的，较自然排卵提前。在取卵后，卵母细胞还需要经过短时间的培养成熟才能受精。通常情况下，依照OCCC不同成熟的情况，成熟培养所用的时间也不相同。
卵母细胞回收中对OCCC的判断较为粗略，颗粒细胞的发育受到高剂量促排卵药物下丘脑促性腺激素的影响，它与卵母细胞核的发育常不一定平行。从最终影响看，对不同的OCCC进行不同时间的成熟培养，在同一批卵母细胞中多次授精操作不利于培养环境的稳定。是否会对最终的结局带来有利影响尚不能得到证实。因此，在实践中大多数机构没有采用依据OCCC成熟情况进行不同时间成熟培养、分次受精的方案，而在卵母细胞回收后4～6 h（或根据HCG注射后40 h左右）一起授精的方案。保障成熟良好的OCCC卵母细胞受精，可能比迁就不成熟OCCC而反复操作更有利于患者的结局。
OCCC成熟培养较为简单。OCCC回收后将其在胚胎培养液内置于5%CO2、95%湿度、37%℃的培养箱内孵育即可。
分离优选的精子受精前需要获能。获能后的精子运动活跃，顶体的流动性和精膜的流动性明显增加，具备发生顶体反应、精卵识别和精卵融合的能力。不同物种精子的获能过程差异较大，其中人类精子的获能较为简单。将精子在受精液内于5%CO2、95%湿度、37%℃的培养箱孵育30 min即可获能。
授精前要将精子悬液调整到适当的密度。不同的授精操作要求的密度不同，以加入受精池的液体不超过其体积的5%～10%、同时满足授精对精子密度的要求为宜。如采用1 mL体积受精的实验体系中，500万/mL即可。
（二）卵母细胞的体外受精
卵母细胞的常规体外受精是通过将卵母细胞与一定密度精子共培养实现的。体外受精的方式和程序很多，各种方式都可以满足临床质量要求，各种方式的优劣尚无定论。依据授精系统的体积，可分为大体积授精（0.5～1 mL）与微授精（0.1 mL）；依据精子与卵母细胞共培养的时间可分为长时受精（16～20 h）与短时受精（2～4 h）；依据受精观察可分为常规去颗粒细胞（受精16～20 h）和提前去颗粒细胞（6～12 h）。
1.体外受精条件
体外受精是否安全有效，除了精子和卵母细胞的质量有关外，还与下面因素密切相关：
（1）受精的培养环境：受精可在胚胎培养液内进行。胚胎培养液以HTF为基础液，含10%～20%的HAS和其他添加剂。培养条件5%～6%CO2，95%湿度，37℃温度。
（2）受精池体积：所谓受精池，就是精子与卵母细胞共培养的培养池。不同的实验室采用的受精池各不相同。受精可以在35 mm培养皿内、1 mL或更大的池内进行，也可以在0.1 mL的液滴内进行，目前通常在30～50ul微滴中进行。过大的培养体积不利于操作中寻找卵母细胞，耗材增加，而过小的培养体积细胞密度过大，不利于培养环境的维持。(https://www.daowen.com)
（3）精子密度：共培养的精子密度对受精具有较大的影响。过低的密度受精下降甚至不受精；过高的密度使培养液环境难以维持，也容易导致多精子受精。受精池内精子的多少、密度的高低与受精池的体积密切相关，维持精子与OCCC一定的相遇概率是关键。尽管在输卵管内，与卵子相遇的精子只有数百个，但由于体外受精的体积较大，一般保持在3万～30万/mL的密度较为必要。体积越大，要求的精子密度越大。此外，受精池内卵母细胞的数量对精子密度的要求也有一定的影响。
（4）共培养时间：原核一般在受精后9～16 h出现。在通常的共培养中，培养时间为16～20 h。但可以确定的是精子穿透的时间在受精后2 h即完成。长时间的共培养不利于受精过程的环境。因此机构采用了短时受精的程序。在短时受精中，精子与卵子共培养2～4 h后，将卵子转移到新的培养液内继续完成受精过程。但这个程序增加了操作过程，有可能对培养环境的稳定带来一定的影响。
（5）去颗粒细胞与受精观察：取去颗粒细胞是观察受精必需的操作，通常在授精后16～20 h进行，此时受精过程完成，合子处于相对安全的状态。但在临床上常常为受精障碍、全部卵子不受精所困扰。此时卵子的老化导致了各种补救措施效果极差。有学者在授精后6～9 h提前去颗粒细胞，通过观察第二极体来判断受精，以便在出现全部卵子不受精的情况下有效地采取补救ICSI。就临床效果来说具有可喜的结果。但在受精过程中，正处于卵母细胞对精子遗传物质进行处理、原核形成阶段，对卵子操作的安全性同样引人关注。有关操作的安全性还需要严格的论证。
2.常规体外受精的操作由于体外受精操作过程的多样性，形成了各种程序组合。目前还不能确定各种程序的效果差异。
1）培养皿准备：培养皿在使用前1 d准备，培养箱内平衡过夜待用。
（1）受精皿：取35 mm培养皿，加入卵裂期培养液1 mL，供受精中精子与卵母细胞共培养用。
（2）胚胎培养皿：与底部按图加卵裂期培养液形成液滴，每滴30～50μL。再加入矿物油，使矿物油覆盖液滴，供受精检查后胚胎培养用。
2）精子准备：将优选分离的精子悬液调整到5×109/mL密度，孵育半小时以上以获能，6 h内使用。
3）受精：将OCCC进行4～6 h成熟培养，转移到受精皿内（2～3个/皿），加入准备好的精子悬液20μL。放入培养箱内培养。
4）取颗粒细胞：培养16～20 h，取出培养皿，用直径150μm毛细玻璃管吹打卵母细胞/受精卵直至颗粒细胞脱落。将卵母细胞/受精卵转移到胚胎培养皿内。
5）受精观察：将胚胎培养皿置于倒置显微镜下检查受精情况。
（孙园园）