PCR技术的原理
利用一对与DNA模板链互补并位于靶DNA两端的寡核苷酸引物经酶促反应合成特异DNA片段的体外方法，该反应包括模板变性、引物退火及引物延伸这三个步骤的重复循环，使每次循环中靶DNA的拷贝数几乎呈几何级数增长，提供足够的靶DNA量供分析使用。
（一）模板变性（denaturation）
双链DNA分子在95℃左右高温下加热，DNA双螺旋配对碱基间的氢键断裂，双链解离成单链DNA；退火（annealing）：降低温度使引物和其互补的模板形成杂交链。由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，模板DNA双链之间互补的机会较多；引物延伸（extension）：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷酸底物及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的5′→3′方向的DNA链延伸反应。经过高温变性，低温退火和中温延伸3个温度的循环，模板上介于两个引物之间的序列不断得到扩增。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍，随着循环次数的增加，目的DNA以指数的形式堆积，数量可达2x105～7拷贝。在反应的最初阶段，原来的DNA担负着起始模板的作用，随着循环次数的递增，由引物引导延伸的片段急剧地增多而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物5′末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物5′端之间的DNA片段。
1.标准的PCR反应体系
一般选用50μl～100μl反应体系，其中含有：
（1）50mmol/L KCl；
（2）10mmol/L Tris—HCl（室温下pH 8.4）；
（3）1.5mmol/L MgCl2；
（4）0.001%明胶或牛血清白蛋白（BSA）；
（5）2个引物，各0.25μmol/L；
（6）d NTP 各50μmol/L～200μmol/L；
（7）模板DNA（人基因组DNA）0.1μg；
（8）Taq DNA聚合酶2.5u。
反应条件一般为94℃变性30s，55℃退火30s，70℃～72℃延伸30s～60s，30个循环。
2.PCR反应的优化
PCR必须具备下述基本条件：（1）模板DNA；（2）工人合成的寡核苷酸引物；（3）合适的缓冲体系；（4）Mg2+；（5）三磷酸脱氧核苷酸；（6）耐热DNA聚合酶；（7）温度循环参数（变性、复性和延伸的温度与时间以及循环数）。另外，还有一些其他因素，如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶或小牛血清白蛋白等对某些特定PCR有一定的影响作用。
3.模板DNA
PCR是以DNA为模板进行的核酸体外扩增。PCR技术对模板DNA的要求是不能混有蛋白酶、核酸酶、Taq酶抑制剂以及能与DNA发生结合的蛋白质等，因为这些物质会影响PCR扩增，另外，残留过高浓度的盐或EDTA都可能抑制PCR反应。PCR反应中模板加入量一般为102～105拷贝的靶序列。反应中仅需加入0.5ngDNA即可。PCR扩增产物的长度、特异性是由特异引物限定的。因此，引物的设计与合成是保证PCR成功的关键因素之一。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
4.设计引物应遵循以下原则
（1）引物长度：15bp～30bp，常用为20bp左右。
（2）引物扩增跨度：以200bp～500bp为宜，特定条件下可扩至10kb的片段。
（3）引物碱基：G+C含量以40%～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
（4）避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3′端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
（5）引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
（6）引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
（7）引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度为0.1umol～1umol或10pmol～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
5.缓冲液
标准缓冲体系为10mmol/L～50mmol/L Tris-HCl（pH8.3～8.8，-20℃）。Tris是一种双极性离子缓冲液，改变反应液的缓冲能力，会引起PCR扩增效率的改变。反应混合液中KCl浓度在50mmol/L下有利于引物的退火，超过50mmol/L的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。加入小牛血清白蛋白（100μg/ml）或明胶（0.001%）或Tween–20 （0.05%～0.1%）有助于酶的稳定，加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段或有抑制剂存在时，加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。
6.Mg2+
Mg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的。因此，反应中优化Mg2+浓度显得十分重要。Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外，也影响着引物的退火、模板与PCR产物的解链温度、产物的特异性和引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。PCR反应中Mg2+浓度在1.5mmol/L～2.5mmol/L。需注意的是，Taq DNA聚合酶需要的是游离的Mg2+，而PCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.5mmol/L～2mmol/L。另外还须注意引物和模板DNA中如含EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。
7.三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）
反应中每种dNTP、dGTP、dTTP和dCTP的终浓度为50μmol/L～200μmol/L，在此范围内，PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。所用的4种dNTP终浓度相等，可使错误掺入率降至最低。4种dNTP的浓度对保持碱基掺入忠实性是很重要的。dNTP终浓度大于50mmol/L时会抑制Taq DNA聚合酶活性。最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。贮备dNTP液应用NaOH调pH至中性，浓度用分光光度计测定。贮备液为5mmol/L～10mmol/L，分装后-20℃保存。另外，dNTP的类似物也可掺入PCR产物。
8.耐热DNA聚合酶
在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。由于该酶的热稳定性差，每次DNA热变性后，该酶绝大部分已失去活性，每一个至数个循环即需添加新酶；Klenow酶反应温度偏低，容易形成引物与DNA模板的非专一性配对，产生非特异性扩增。温度低，反应易受某些DNA二级结构的影响而得不到完整的扩增产物。Klenow酶的热稳定性差和使用不便限制了其在PCR反应中的应用。以后人们曾使用T4 DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶，两者虽使扩增特异性增加和DNA合成速度提高，但终因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热DNA聚合酶（如Taq DNA polymerase）应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛的应用。
自从耐热Taq DNA聚合酶引入PCR后，又发现了多种耐热的DNA聚合酶，有多种耐热DNA聚合酶（VENT 和Tth等）相继用于PCR。其中，VentTM DNA聚合酶是美国New England Biolabs公司从海底火山口中在近100℃高温下生长的Thermoccus litoralis菌中提纯得到的，性能比Taq DNA聚合酶更优越的另一个耐热酶。该酶在100℃时半衰期达95min，此外还具有3′→5′外切酶活性。但目前仍以Taq DNA聚合酶应用较多。不同来源聚合酶制备条件、测定方法、单位定义有所不同，使用时需加以注意。
Gold Taq DNA聚合酶是Taq DNA经过化学修饰的酶，热稳定性、特异性好，酶延伸反应需在高温（95℃）激发。
（三）PCR分析中应注意的问题
PCR对模板DNA的要求不高，一般实验制备的模板DNA都能满足PCR的要求，但在法医物证检验的实践中，从案发现场提取的检材则是千变万化的。因而PCR用于物证检验时，必须就检材的具体条件作一些特殊考虑，以保证获取正确可靠的扩增结果。
DNA降解是生物学检材检验中经常遇到的问题，常见于腐败组织、陈旧检材、血斑、远古标本以及用福尔马林等防腐剂保存的标本等。能够对降解DNA进行分型鉴定是PCR技术的优势之一，特别是对于部分降解的DNA样品大都可以获得良好的扩增效果。对于严重降解的DNA样品，目的片段大于200bp的位点都无法得到有效扩增，而只有目的片段小于200bp的位点可被成功地扩增，这便是PCR技术中STR位点的突出优点。
除了降解因素之外，环境因素的影响也可导致物证检材中DNA的改变。如阳光紫外线的照射、化学试剂的作用等，都可影响物证样品中的DNA的扩增效率。虽然现在尚不清楚损伤模板在Taq酶的作用下是易于产生错误的掺入，还是不能往下进行DNA链的延伸，但是已有实验证实受损DNA模板的扩增效率降低了，并不会产生错误的分型。如两份同一样品的DNA，一份经过紫外线照射，另一份未经过紫外线的照射，扩增分析的结果表明，经紫外线照射样品扩增产量降低了，但是扩增产物的DNA分型则是相同的。
DNA样品中抑制性物质的存在与否是关系到PCR成败的重要因素，现在实验证实，土壤、深色染料、血红素的衍生物等可能是物证样品中经常含有的抑制物，对含此类物质的DNA样品的扩增往往难以成功。加入额外的Taq酶或扩增前稀释DNA可以减轻这些抑制物的作用，有时DNA经色谱柱、低熔点琼脂糖凝胶的纯化或透析袋透析等处理之后可获得良好的扩增结果，但有些DNA即使经过上述方法处理，也难以获得有效扩增，可能是抑制物与DNA结合无法去除之故。以Chelex法处理这类检材，有良好效果，这可能是Chelex与DNA竞争结合抑制物，从而解除抑制物对PCR反应抑制作用的缘故。
物证检验中另一个需要注意的问题是物证检材中是否混有其他来源的DNA。虽然真菌和细菌等原核心生物DNA可能污染物证样品DNA，但是这些DNA不会被以人类DNA序列设计的引物所扩增。此外，混入外源性DNA最可能机会是在样品的处理过程中，外源性DNA可来自样品间的交叉污染，或来自以前反应中的PCR产物。
为解决上述可能出现的混合样品问题，可采取一系列相应的预防措施。第一，要对案发现场的物证进行仔细的检查，做到正确收集物证检材；第二，物证样品的DNA分离、PCR扩增反应及产物检测应分别在不同的实验区进行，可能含微量DNA的样品应与含大量DNA的样品分开单独处理；第三，在物证DNA的提取和分析过程中应使用无菌的试剂、无菌干净的吸头和离心管以及一次性手套等，每个实验区应有单独的一套移液器；第四，扩增反应加样过程应在超净台上进行，以最大可能地防止交叉污染，同时，应尽可能把产物检测固定在专用实验房间，以防止其扩散而污染PCR反应。
在进行Amp– FLP分析中还存在一些潜在的问题，实际检验时应加以注意。第一，如果DNA样品降解严重，较大的等位基因可能不被扩增或者由于某种原因两个等位基因不同时被扩增，就会使杂合子样品呈现为纯合子型，从而作出错误的判断。第二，如果一个样品中两个等位基因片段差别较大，在扩增产物中的量会产生明显差异，分型时要特别加以注意，以免造成误判。适当增加PCR反应的延伸时间，或在正常扩增步骤前增加一个样品在低引物浓度进行几个循环的步骤，都有助于减弱这种扩增产物中大小两个等位基因的产量不平衡性。第三，Amp – FLP是扩增含量重复单位的位点，扩增过程中会由于某种特殊的配对，TaqDNA聚合酶可能将某些区域在产物中拷贝一次以上，产生一些大于靶序列的非特异扩增产物，这在分析结果时也应特别引起注意。