DNA 损伤试验
单细胞凝胶电泳技术
1978年,哈纳沃特(Hanawalt)等最先提出单细胞DNA 损伤的定量测定方法——单细胞凝胶电泳技术(Single Cell Gel Electrophoresis,SCGE)。该技术能检测细胞群中DNA 损伤与修复在细胞间的差异。
1984年,奥斯特林(Ostling)等应用中性凝胶电泳技术使检出灵敏度得到进一步提高。
1988年,辛格(Singh)等提出的碱性电泳技术更加优越,用溴化乙锭(EB)染色能显示遇碱不稳定位点和明显DNA片段。每个受损细胞在电泳时,其DNA从核中向阳极伸展,形成一个亮光头部和尾部,形似彗星,故又名彗星试验[2]。
1990年,奥利夫(Olive)等报道,断裂DNA 数目变化四倍时,其尾长仅变化21%,而尾中荧光强度几乎增加一倍。现在SCGE 分析指标中就有以Olive 命名的Olive 尾矩。
1995年,孟紫强在应用放射性同位素标记方法和碱解旋速率法研究γ 射线对在体外培养的哺乳类细胞DNA 合成、损伤和修复的基础上,进行不同试验条件对SCGE 技术灵敏度影响的研究,同时也证明了SCGE 是测定氯化镉、过氧化氢或γ射线引起DNA 损伤的灵敏方法。
RAPD 技术
1985年,杰弗里(Jeffrey)等第一次在人类基因组中发现高变的小卫星区域,奠定了DNA 指纹技术的基础。
1985年,莫里斯(Мullis)发明了聚合酶链式反应技术(PCR),该技术的建立使得环境污染物对生物体中某个特定基因的检测与研究成为可能。
20世纪90年代,随着PCR 技术的广泛应用,DNA 的多态性可通过体外克隆方法快速、高效、灵敏地检测出来。在PCR 技术基础上发展起来的检测DNA 多态性的分子标记技术,也称为DNA 指纹技术。其中应用最多的是随机扩增多态性技术( Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD),这一典型、有效的DNA指纹技术,是用基因组DNA 随机扩增的方法来鉴别DNA 多态性的。
DNA 加合物的测定
污染物如多环芳烃(PAH)等被生物体吸收后,经过代谢转化为活性的亲电物质。这些亲电化合物能与DNA 共价结合形成DNA 加合物,从而引起DNA 结构的改变。DNA 加合物一旦逃避自身的修复,就可能成为化学致癌、致畸、致突变的最小因子。定量测定DNA 加合物即可初步判定样品的遗传毒性。
DNA 加合物的测定方法主要有以下三大类:免疫法、荧光法和磷-32-后标记法。磷-32-后标记法是近期较常用的DNA 加合物的半定量检测方法,他由兰德瑞斯(Randerath)于1981年建立。1991年孟紫强应用磷-32-后标记技术研究,发现苯醌和氢醌等化学物可与人血淋巴细胞DNA 形成加合物。
姐妹染色单体交换试验
每条染色体是由两条染色单体组成的,一条染色体的两个染色单体间DNA的互相交换,称姐妹染色单体互换(SCE),它可能与DNA 断裂和重联相关。
从1986年开始,孟紫强研究组在二氧化硫诱发细胞染色体畸变、微核、SCE和显性致死等方面进行了一系列环境和生态毒理学研究[3]。