青海省都兰县唐代吐蕃墓葬人骨线粒体DNA研究

崔银秋 段然慧 周慧 朱泓（吉林大学边疆考古研究中心考古DNA实验室）

北京大学考古文博学院和青海省文物考古研究所于1999年7—9月在青海省都兰县热水乡血渭草场热水沟南岸发掘了4座唐代的大、中型吐蕃墓葬。[1]墓地位于海拔3400多m的高原地带，经纬度位置为北纬36°09′41″、东经98°17′11″。墓葬集中分布在一山谷两侧的山脚下，与该墓地最大的吐蕃陵墓（都兰一号大墓）隔河相望，位于后者的右翼。热水乡位于柴达木盆地东缘，气候干旱，空气稀薄，太阳总辐射能量较高，气温日较差大，多风，降水量较少，属温凉干旱气候区。本次所发掘的4座墓葬位于察汗乌苏河南岸的牧场上，植被为草原荒漠植被，比较稀疏。土壤属棕钙土，有盐化现象，碱性反应，钙积层位高，且4座墓墓室均比较深，文物在墓中处于无光、缺氧、稳定的温度和湿度环境中，并与略为潮湿、含有可溶盐的土壤接触。这种特定的自然环境，使一些弥足珍贵的有机质文物（漆器、彩绘木构件、纺织品、皮革、纸张、动物骸骨等）能够保存至今。我们采集了3例古代人骨样本进行古DNA的研究，我们的目的在于通过对所采集的样本中的线粒体DNA进行序列分析，重建当地古代居民的系统发育关系，从而了解当地居民的起源和发展的历史轨迹。

1 实验部分

本实验的3个样本（99DRNM1，99DRNM2，99DRNM4）采自青海省都兰县的唐代吐蕃墓葬，遗骸的保存状态良好，骨骼两端完整，骨体无裂纹、破损。首先去除骨样表面的污染，然后将之打磨成骨粉。使用GENECLEAN for Ancient DNA试剂盒（BI010I，USA)进行DNA的提取，然后利用4对套叠性引物对线粒体DNA上的长度为313bp的片段进行扩增。使用QLAEXⅡGEL Extraction Kit（QIAGen，Gennany）纯化PCR产物，用于双链DNA直接测序（ABI Model 310）。[2,3]所得到的序列数据用Clustal X进行序列对准后，使用MEGA 2.1软件包进行数据分析。[4]用于比较分析的群体数据从Genebank中获得。[5,6]系统树的每个分支的统计学显著性分析由自举法（Bootstrapping）完成。重复次数为1000次（表1）。

表1 扩增用引物序列以及扩增产物的长度

注：①所标数字是指该引物的3′末端的碱基在线粒体基因组中的位置，碱基编码是根据Anderson等1981年发表的线粒体基因组的全序列，得出L和H分别代表环状的线粒体DNA子中的重链和轻链。②实验自行设计的引物用*标记，其余引物引自Handt O et al，1996的文献。[7]

2 结果

线粒体DNA片段从所有3个样本中成功地扩增出来。所有的抽提和扩增的空白对照都为阴性，表明在骨样的抽提和扩增过程中无可观察到的污染发生。4对重叠引物扩增出的片段可连接成一条313bp的高可变区的序列，测序结果列在表2中，在3个序列中，共发现3个DNA序列（haplotype）、8个核酸变异位点。1号样本有5个变异点：16141（A→T），16183（A→C），16223（C→T），16225（C→A），16234（C→T）；2号样本有3个变异点：16145（G→A），16209（T→C），16223（C→T）；3号样本有4个变异点：16183（A→C）、16209（T→C），16223（C→T），16319（G→A）。

我们将青海都兰的序列与现代藏族（Tibetan）的序列进行了比较，并构建了系统发育树（见图）。结果显示青海都兰的3个线粒体DNA序列分散在现代藏族的序列之中，未形成独立的分支。

3 讨论

过去，人们通过对人类的遗骸进行宏观检查并辅以文化和地域环境的分析来进行探讨人类进化中各种群间的进化关系。随着分子生物学技术的发展，我们已经可以将古遗骸中的残余的核酸分子抽提出来，并通过PCR技术将之扩增，进而得到序列信息，使我们可以进行直接的系统发育分析。[8]因为无须特殊的设备和分析方法，古DNA的研究从技术的角度，已无任何困难。它的最大的障碍是古DNA的污染问题。污染主要来自两个方面：一是样品本身如埋葬以及挖掘过程中的，二是来自实验室的污染。对于前者，我们主要是通过对样品的处理将之清除；实验室的污染可以通过设立抽提和扩增对照组来排除。同时保证实验用品及试剂的无核酸污染（用品为一次性，试剂分装）。另外，对相同的个体在不同的时间和地点进行两次独立的重复实验，检验结果的可重复性也是鉴别古DNA是否被污染的有效手段。另一个检验结果可靠性的标准是根据古DNA的一个特性：即扩增长度与扩增效率的负相关性。如前所述，古DNA模板一般被降解成200bp左右的小分子，因此，扩增的长度越长，则成功率越低。相反，对于现代DNA来说，扩增500bp以内长度的片段的效率与100bp几乎相同。这一特性常常用于观察和分辨相对现代的污染。比如：从Quagga中的抽提物的PCR扩增反应，常规扩增小DNA片段（140bp）产生Quagga序列，而零星出现的长的扩增产物，则毫无疑问是现代的序列。[9]

表2 青海省都兰县唐代吐蕃墓葬人骨线粒体DNA序列

本实验的样本取自青海省都兰县热水乡血渭草场热水沟南岸的3座唐代的中、大型吐蕃墓葬，从出土物如丝织品的技法及纹样、陶器、古藏文的字体等方面来看，墓葬的年代应当在中晚唐时期。若所出木简RB115. Ki22（99DRNM1：36）如王天挺（尧）所言，99DRNM1墓主人为公元757年死于任上名叫“甲贡”的尚论思结桑的话，那99DRNM1墓主人的族属无疑是吐蕃，而非吐谷浑。同时99DRNM1也是第一座可以明确断定墓主人的吐蕃墓葬。从99DRNM1和99DRNM3（？）的比较来看，似已可断定99DRNM3（？）墓主人的族属也应该是吐蕃。[1]由此可见，本文所研究的这批古人骨的族属当系唐代的吐蕃人。

图 青海都兰古代人骨线粒体DNA与现代藏族（Tibetan）人群序列间的无根邻接树使用MEGA程序的Kimura-2参数模型构建

本实验的样本中，3个样本都含有16223（C→T）的取代，这一位点在中亚、东亚的谱系中占有一很大的比例（蒙古为65%，日本为40.7%），在现代的藏族群体中的比例更大，占97.5%，而这一位点的变异化在欧洲的谱系中却很少见，只占70%左右。另外，16319（C→A）位点变异在东亚的汉族人群为17.3%，在日本的阿伊努（Ainu）人群为3.9%，在欧洲的人群中就更低，在西班牙的巴斯克（Basques）人群为2.3%，在地中海的撒丁岛（Sandinia）为1.4%，但此位点在藏族人群中的比例却很高，约占32.5%。我们使用MECA程序的Kimura-2参数模型构建了青海都兰序列与现代藏族序列之间的系统发育树（见图），结果显示青海都兰唐代吐蕃人的3个线粒体DNA序列分散在现代藏族人群的序列之中，未形成独立的分支。从实验的结果我们可以推断这3个古代序列应属于亚洲谱系，关系与现代的藏族人群比较接近。当然，更多的样本及更长的序列无疑将为这一地区的遗传谱系的系统发育提供更详细的资料。

致谢：本文所研究的古人骨样本由北京大学考古文博学院齐东方教授提供。

2004年5月

参考文献

[1] 北京大学考古文博学院，青海省文物考古研究所. 都兰县热水吐蕃大墓[M]//中国考古学会. 中国考古学年鉴：2000. 北京：文物出版社，2002：283-284.

[2] Pääbo S., Higuchi R., Wilson A. Ancient DNA and the Polymerase Chain Reaction [J]. The Journal of Biological Chemistry. 1989, 264: 9709-9712.

[3] Hoss, M. DNA Damage and DNA Sequence Retneval from Ancient Tissues [J]. Nucleic Acids Res. 1996, 24(7): 304-1307.

[4] Sudhir Kumar, Koichiro Tamura, Ingrid B. Jakobsen, Masatoshi Nei. MEGA2: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Software. Bioinformatics (Submitted). 2001.

[5] Horai S., Murayama K., Hayasaka K., Matsubayashi S., Hattori Y., Fucharoen G., Harihara S. mt DNA Polymor-phism in East Asian Populations, with Special Reference to the Peopling of Japan [J]. Am J. Hum Genet. 1996, 59: 579-590.

[6] Torroni A., Miller J. A., Moore L. G., Zamudio S., Zhuang J., Droma T., Wallace D. C. Mitochondrial DNA Analysis in Tibet: Implications for the Origin of the Tibetan Population and Its Adaptation to High Altitude [J]. Am J. Phys Anthropol. 1994, 93(2): 189-199.

[7] Handt O. The Retrieval of Ancient Human DNA Sequences [J]. Am J. Hum Genet, 1996, 59(2): 368-376.

[8] Higuchi R., Bowman B., Freiberger M., Ryder O. A., Wilson A. C. DNA Sequences from the Quagga, an Extinct Member of the Horse Family [J]. Nature. 1984, 312(5991): 282-284.

[9] Brown T., Brown K. Ancient DNA and the Archaeologist [J] Antiquity. 1992, 66: 10-23.

Abstract

Three mitochondrial DNA samples are successfully extracted from four individual bones from the Tubo tombs in Tang Dynasty in Dulan County, Qinghai Province. Through four overlapping primers, a nucleotide sequence of 313bp length is obtained. The result of the sequence analysis of ancient mtDNA shows that three haplotypes with 8 polymorphic sites are found. Phylogenetic analysis indicates that three sequences are scattered among modern Tibetan sequences and have not developed into independent clusters. So our preliminary data implies that Dulan sequence belongs to the Asian pedigree and has a relatively close relationship with the modern Tibetan people who had existed prior to the early Iron Age.