基于RT-PCR的循环肝癌细胞检测方法
（一）RT-PCR检测循环肝癌细胞的分子生物学基础
血液中存在丰富的核糖核酸酶使其中游离RNA无法存在是基于RT-PCR检测CTC的理论依据。有实验证实，总量10μg的HepG2细胞总RNA与5ml健康人血样混合后，HepG2中高丰度特异表达的AFP mRNA无法被检测到。如果外周血检出肝癌特异mRNA则说明血液中存在产生对应mRNA的完整细胞。特异mRNA与CTC在时空上的一致性是RT-PCR检测循环肝癌细胞的分子生物学基础。
（二）应用白蛋白mRNA作为转录标志物检测循环肝癌细胞
从肝癌患者外周血循环中检测CTC的工作最早报道于1991年美国肝脏研究协会的专题研讨会。白蛋白mRNA被作为转录标志物，以白蛋白基因外显子3和4的序列为引物作PCR，其敏感阈为5个Hep3B肝癌细胞/106个MCF7细胞（乳腺癌细胞系）。检测6例健康志愿者、10例肝硬化患者、10例继发性肝转移患者以及10例经肝移植的非肿瘤患者，结果均为阴性，也未发现医源性播散的CTC。但是，另有报道应用RT-PCR检测到健康志愿者外周血白蛋白mRNA，提示白蛋白基因在非肝源性细胞（尤其是白细胞）也有低水平转录。后来有人采用两套白蛋白基因特异性引物作巢式PCR，发现7例健康志愿者中有6例阳性。其他实验室采用同样方法也得到类似结果。Louha等釆用非巢式方法，从10例健康志愿者检出5例阳性。还有人从大鼠睾丸、子宫、胎盘及人的肺和胃等非肝脏组织中检测到白蛋白转录物。Muller等采用非巢式PCR方法，以白蛋白mRNA为转录标志物进行了广泛研究，结果28例健康志愿者有8例阳性，19例急性肝炎患者18例阳性，25例慢性肝炎患者22例阳性。如果将本来阴性的健康者外周血白细胞用不同的丝裂素和白介素刺激3天，结果转为阳性。提示外周血白细胞中白蛋白基因低水平转录不是随机事件，而是白细胞活化的结果。
从以上研究结果可以看出，多种原因可以导致mRNA的非特异性扩增。因此，白蛋白mRNA作为肝癌CTC标志物的特异性较差，目前已被弃用。
（三）应用AFPmRNA作为转录标志物检测循环肝癌细胞(https://www.daowen.com)
采用AFP mRNA作为转录标志物检测肝癌患者CTC的报道最初见于1994年，结果26例健康志愿者均为阴性，而33例肝癌患者中17例阳性，其中6例肝外转移的肝癌患者均呈阳性，30例慢性肝炎和（或）肝硬化患者中4例阳性。Komeda等采用类似方法，检测的阳性率与TNM分期（IV期）、肿瘤＞5cm、血清AFP浓度高于300μg/L以及肝内外转移关系密切。Louha等应用优化的RT-PCR方法检测，也发现检测阳性率与肝内癌栓形成、门静脉癌栓形成、肿瘤＞3cm和血清AFP浓度＞500μg/L有关，随访显示阳性检测结果与发生肝外转移癌的危险性密切相关。有人对肝癌患者外周血中AFP mRNA的检出与预后的关系进行了前瞻性研究，发现手术前、后持续阳性者有较高的复发率，手术后阳性的患者复发的时间明显早于阴性的患者。
也有相当部分研究对AFP mRNA的特异性提出了质疑。首先，AFP mRNA在急、慢性肝炎患者和正常人的外周血中也呈阳性。Mutsumura等发现4/30肝硬化和（或）肝炎患者外周血AFP mRNA阳性。Kedda等发现AFP mRNA在53%（35/66）黑人肝癌患者外周血中为阳性，同时也见于45%（10/22）健康黑人。64%（14/22）急性肝炎患者、55%（11/20）慢性肝炎/肝硬化患者和75%（9/12）其他肿瘤肝转移的患者。Jiang等也发现7/13肝炎患者外周血中AFP mRNA为阳性，所检测的5例孕妇的外周血和其婴儿的脐带血全部为阳性。其次，侵袭性操作可同时引起肝细胞和肝癌细胞进入血液循环中。Louha等检测了肝癌患者和非肝癌患者在肝切除术和针吸活检前、后外周血AFP mRNA表达情况。在14例肝癌患者中，12例接受了肝切除术，2例接受了针吸活检术。在36例非肝癌患者中，16例接受了肝切除术，20例接受了针吸活检术。术前6/14肝癌患者AFP mRNA阳性，0/36非肝癌患者AFP mRNA阳性。术后14/14肝癌患者AFP mRNA阳性，23/36非肝癌患者AFP mRNA阳性。可见肝切除术和针吸活检会引起肝癌细胞和正常肝细胞向外周血液循环中扩散。该研究还显示，在切肝前牵动肝脏时最容易发生医源性肝细胞扩散。其原因可能是肝脏具有海绵状结构，牵动肝脏可使器官伸展和压缩。因此，在铂夹较大的肝静脉前，肝癌细胞可能已扩散到血循环中。事实上，这一点已经被免疫细胞学所证实。在这种情况下进行外周血AFP mRNA检测，将无法区分出AFP mRNA究竟是来自肝细胞还是肝癌细胞。
另有研究显示，在术后约1~2周，这些正常肝细胞将不会被RT-PCR的方法检测到。由此可推测术后1~2周后检测外周血AFP mRNA结果可能会更加特异。Ding等通过对国内外文献的meta分析所得结论支持这一推测，即手术1周后外周血AFP mRNA是较好的肝癌复发预测指标。
（四）基于RT-PCR的循环肝癌细胞检测方法的局限性
除了以上提到的特异性和重现性等问题，RT-PCR尚存在其他局限。一方面，RT-PCR检测不能估算样本中肿瘤细胞的数目，因为单个肿瘤细胞之间目的RNA的转录率是不同的。而循环中肿瘤细胞的数目与肿瘤负荷和转移发生的风险有关。另一个主要局限是，RT-PCR检测须破坏细胞形态，如此则不能对单个肿瘤细胞进行观察、分析和计数。而这些数据可提供CTC恶性程度和侵袭性方面的信息。也就是说，RT-PCR不能检测CTC中与侵袭相关的基因表达（如金属蛋白酶基因），因为这些基因在白细胞等生理性浸润细胞中也有表达。亦不能用于检测单个CTC中DNA突变（如p53或βcatenin突变），因为白细胞的非突变DNA会掩盖突变信号。