基于细胞分离的循环肝癌细胞检测方法

先将CTC分离富集然后进行检测，其优点在于可进行CTC形态观察和计数，并可进行基因型分析等分子生物学鉴定。常见的CTC分离方法多是基于单克隆抗体对带有特异表面标记的肿瘤细胞的识别，包括荧光激活细胞分选技术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）、磁性激活细胞分选技术（magnetic activated cell sorting，MACS）等。由于缺乏相应的肝癌细胞表面标记单克隆抗体，迄今未见FACS用于分选肝癌CTC的报道。有研究者用上皮细胞抗体Ber-EP4磁珠进行MACS分选循环肝癌细胞，而Ber-EP4抗体只能识别约67%肝癌细胞，回收率显然不够理想。

2000年Vona等报道了一种根据上皮肿瘤细胞的大小分离CTC的方法（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）。由于上皮肿瘤细胞比外周血细胞大，通过过滤可使上皮肿瘤细胞得到分离。据报道，该方法敏感度高，在1ml血中加入1个肿瘤细胞亦可检出，分离所获细胞形态完整。由于不是根据细胞抗原而是根据细胞大小分离CTC，故同一方法可适用于多种类型的肿瘤，甚至可用于在产前遗传咨询方面需要检查的滋养细胞。研究还显示，对于肝癌患者CTC的分离，该方法的敏感性高于RT-PCR方法。最近Zheng等对这一方法作了改进，引入了微型电子机械系统（micro-electromechanical system，MEMS），使得操作更加简单、快捷。然而，考虑到CTC大小和形状的异质性，该方法的敏感性和重复性还有待进一步验证。(https://www.daowen.com)

我们实验室在循环肝癌细胞的分离方面也做了很多工作。早已发现，哺乳动物的肝实质细胞膜表面存在一种肝结合蛋白一去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR），又称半乳糖受体。ASGPR是一种跨膜蛋白，其胞外结构域含有糖识别区（carbohydrate recognition domain，CRD），能专一性识别和结合以半乳糖残基和N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白。ASGPR专一性表达于哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞表面，密度很高，每个肝细胞表面可多达500000个受体。利用这一特性，我们创建了基于ASGPR的MACS分离循环肝癌细胞的技术，回收率显著高于采用Ber-EP4磁珠的分选方法，从而解决了由于缺乏肝癌细胞表面单克隆抗体所面临的困扰。循环肝癌细胞是肝癌转移的一个重要环节。以其作为切入点对其相关的基础和临床问题进行多方位研究，不仅具有许多重要的临床应用价值，而且可能在这一环节上形成突破口，阐明肝癌转移复发的机制，找到控制肝癌转移的有效手段。可以预见，随着循环肝癌细胞检测技术的成熟和循环肝癌细胞临床意义的进一步阐明，循环肝癌细胞有可能作为一个独立指标用于肝癌分期，并在肝癌诊断、转移复发预测、指导治疗方案的制定和监测疗效等方面发挥重要作用。