12.1.3　营养基因组学的常用研究方法

营养基因组学的发展得益于分子生物学和基因组学的发展，主要利用各种组学，包括基因组学、蛋白质组学、代谢组学等提供的研究手段，系统地研究营养与基因功能的关系。

1.基因芯片技术　基因芯片技术主要用于鉴定序列（基因/基因突变）和鉴定基因的表达水平，为研究极为复杂的营养对基因表达与健康的关系提供了有效工具。如目前已有的推荐膳食供给量都不是根据基因表达来制定的，而且也只有极少数是根据生化指标来制定的，而应用含有人全部基因的cDNA芯片来研究在营养素缺乏、适宜和过剩等状况下的基因表达图谱，将更为全面地发现用来评价营养状况的分子生物标志物，为制定更准确、合理的膳食参考摄入量提供分子基础。此外，应用基因芯片技术将阐明与营养相关的单核苷酸多态性（SNPs），并用来研究人体对某些疾病的易感性以及对营养素需求的个体间差异。

目前，在营养基因组学研究领域所使用的微阵列（芯片）技术只能使我们得到一个框架性结果，并且因为基因芯片成本较高，一般采用RNA混合样本进行分析，阵列数也有限，而要得到更稳定和可靠的数据，还有必要分析在不同时间序列点的基因表达，以及重复多次和有统计学意义的分析。随着今后商业化芯片的价格不断下降，以及小规模微阵列的出现，通过基因芯片技术可能会得到更好的分析数据。此外，试验设计、微阵列分析和数据收集均应采用标准方法。ArrayExpress（www.ebi.ac.uk/arrayexpress）是由欧洲生物信息研究所（EBI）提供的关于微阵列实验信息收集的数据库。

2.mRNA差异显示技术　mRNA差异显示（differential display，DD）方法的基本原理是将具有可比性的细胞在某一条件下可表达的mRNA群体通过逆转录方法变成相应的cDNA群体，以此为模板，利用一对特殊引物，即3'anchor引物和5'arbitrary引物，在一定条件下进行PCR扩增，得到与mRNA相对应的“标签”（tags），然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其结构与功能。Blanchard应用mRNA差异显示技术比较了缺锌与常锌大鼠小肠基因表达的变化，结果发现因缺锌所致的小肠中两种肽类激素、小肠脂肪酸结合蛋白、小肠碱性磷酸酶Ⅱ等的mRNA均发生显著变化。

3.生物学标记　生物标志物（biomarker）通常是与疾病发生相关的蛋白质，在疾病的诊断、分级、预后及治疗监测过程中常被作为诊断指标进行定量测定。基因组、蛋白质组技术因为能在特定的条件下规模化地研究基因和蛋白质的表达情况，为生物标志物的发现、鉴定和评价提供了有力的技术平台。膳食营养研究发现在营养素参与疾病发生的初期预防中，相关的人体干扰研究都用生物标志来确定营养素干扰的作用。将基因组学技术用于营养研究，将许多小变化组合成新的生物标记使生物标记变得非常灵敏，可以做到对病变的早期诊断。

4.建立营养基因组学数据库　近年来，Saito等人建立了一个能够分享关于基因组学研究的出版物和基因表达信息集成的数据库，称为“营养基因组学数据库”。作为研究的起始阶段，数据库中来自200多个出版刊物的信息被收集和整理，并链接了一些芯片数据库（来自NCBI的公共域www.ncbi.nlm.nihgov）。这个数据库建立在一个资源开放的数据库系统且免费登录互联网（http://a-yo5.ch.a.utokyo.ac.jp/index.phtml），研究者在研究营养素的生物作用方面能够在分子、细胞及生物个体的水平上找到线索。因为提供的营养学和食品学的数据集仍是有限的，所以数据需要适时人工改动更新。现阶段数据库包含200多项营养基因组学的研究和对营养学产生影响的300多项药理学及毒物代谢动力学的研究。

5.营养基因组学研究中的细胞生物学和遗传学工具　由于目前对哺乳动物体内编码的开放阅读框架知之甚少，所以利用动物模型进行基因功能的研究就尤为重要。由于我们并不清楚与基因或蛋白质异常表型有关的出生代谢缺陷的根本原因，因此有必要通过相对简单的动物模型来研究一个或一组基因在代谢过程中的作用。利用目标基因失活（基因敲除“knock-out”）或目标基因选择性超量表达（基因敲入“knock-in”）的动物模型包括果蝇、线虫、大鼠、小鼠或人类细胞株，最终用于阐明单个基因在复杂代谢过程中的作用。动物体内进行的更高级的转基因技术还包括利用细胞、组织特异性或时间依赖性的基因失活或诱导高表达，以更准确的揭示表型结果。对于简单细胞模型或者复杂器官（最好的例证是秀丽隐杆线虫），采用RNA干扰（RNAi）技术也可以比较方便地抑制或明显降低蛋白表达水平。