发现青蒿抗疟活性的化学部位

1971年4月15日，国务院、中央军委以（71）国发字29号文，批转了卫生部军管会、燃料化工部、中国科学院、中国人民解放军总后勤部《关于疟疾防治研究工作情况的请示报告》。1971年5月22日至6月1日，遵照国务院、中央军委（71）国发29号文的批示，全国疟疾防治研究领导小组，在广州召开疟疾防治研究工作座谈会。中医研究院派屠呦呦和院属针灸研究所的曹庆淑参加了会议。广州会议，传达了周恩来总理5月28日对加强热带地区恶性疟疾防治研究工作的重要指示，会议对前期全国抗疟研究情况进行了总结，并提出了疟疾防治研究工作五年规划的重点与要求。

广州会议后，确定中医研究院要继续承担部分中医中药防治疟疾的研究任务，于当年7月初，中医研究院领导在全院抽调相关人员，加强、调整和组成了中西医结合、基础临床结合、针药结合的疟疾防治研究小组，同时还举办了为期5天的学习班，统一提高认识、研究部署工作。其中，药物筛选工作继续由屠呦呦负责，郎林福、钟裕蓉、刘菊福参加。

筛选工作离不开动物模型，在军事医学科学院微生物流行病研究所等的帮助下，中医研究院中药所建立了鼠疟动物模型。至1971年9月初，他们高强度地筛选了100余个中药的水提取物和醇提取物200余种，但结果不理想。筛过的中药包括青蒿（Artemisia annua L.），其对疟原虫的抑制率高时也只有40%左右。在前期的实验研究中，由于胡椒提取物对鼠疟曾有较高的抑制率，有的批次抑制率高达84%，然而试用于临床，该提取物对疟原虫的抑制杀灭作用并不理想。在对青蒿的筛选中，虽曾出现过对疟原虫的抑制率达68%的结果，然而此后的多批次研究却不能重现较高的抑制率。

带着问题，屠呦呦再次请教中医专家，并对以往研究过的几个药物的历代文献进行重新温习。如青蒿，在中国的应用已有二千多年的历史，《神农本草经》就有记载，青蒿治疗疟疾则始于公元340年间的东晋葛洪《肘后备急方》，之后，宋代《圣济总录》，元代《丹溪心法》，明代《普济方》等著作均有“青蒿汤”“青蒿丸”“青蒿散截疟”的记载。明代李时珍在《本草纲目》中，除收录了前人的经验外，还载有治疗疟疾寒热的实践，清代《温病条辨》《本草备要》，以及民间都有青蒿治疗疟疾的应用。在服法上，一般均作汤剂。在反复研读文献过程中，葛洪《肘后备急方》中“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之”治疗寒热诸疟的描述，给了屠呦呦新的启迪。古人以“绞汁”的用法令她悟到之前青蒿的提取常用水煎煮或者用乙醇提取，但结果都不好，青蒿中的有效成分跟提取温度也许有关系，并且想到只有嫩的枝叶才会绞出汁来，这是否还涉及药用部位的问题。于是又重新设计了以乙醚低温提取青蒿的研究方案，果然发现青蒿乙醚提取物，对鼠疟模型有较高的效价，但杂质比较多，且有一定毒性，遂又将提取物分为中性和酸性两部分。实验证明，酸性部分具较强毒性又无效，而中性部分才是抗疟活性集中的有效部位。1971年10月4日，药物研究序号为第191号（又简称为91#）的青蒿乙醚中性提取物，展现了令人振奋的结果，对疟原虫的抑制率达100%。此后，屠呦呦及其课题组又不断完善提取、精制方案，制备样品，并在猴疟模型上证实乙醚中性提取物的抗疟活性。后来实验证明，确实只有青蒿叶子才含有抗疟活性成分——青蒿素，占大量份额的坚硬茎秆中青蒿素的含量是极低的；而且北京周围所产青蒿的青蒿素含量低，只及云南、贵州、四川青蒿的1/10。1972年3月8日召开的抗疟药研究“523”内部南京会议上，屠呦呦报告了青蒿及其乙醚中性提取物对鼠疟、猴疟具有良好抗疟作用的发现。会后，全国“523”办公室要求中研院中药所当年将此提取物带到海南疟区现场进行临床疗效观察。

要进行临床研究，就必须先制备大量的青蒿乙醚中性提取物，用以临床前的安全性等试验和制备临床观察用药。但当时处于“文革”期间，没有药厂配合工作，短时间内提取大量的青蒿提取物在当时是很困难的。屠呦呦课题组只能在非常困难的情况下，因陋就简，甚至买来盛水的大缸充当提取锅用，加班加点，终于得到了足够的青蒿乙醚中性提取物。在经过动物毒性试验后，为确保药物对人体的安全性，屠呦呦给领导打报告，愿以身试药，经领导研究，同意屠呦呦的申请。于是屠呦呦及课题组其他两位响应的同事，共3人住进了医院，按照人体探路试服方案，在严密监控的情况下，于1972年7月，开始了青蒿提取物的人体试验。经1周观察，未发现该提取物对人体有明显毒副作用，3位受试者情况良好，除个别人个别指标有一过性波动，肝肾功能及心脏相关指标正常。8月初，又增加做了5例人体试服，亦未发现明显的毒副作用，才同意上临床。于是屠呦呦亲自携药赶赴海南昌江疟区，亲自给患者喂药，以确保用药剂量，并守在床边观察病情，测量体温，详细了解血片检查后的疟原虫数量变化等情况。最终完成了海南疟区间日疟11例，恶性疟9例，混合感染1例的21例临床抗疟疗效观察，取得间日疟平均退热时间19小时，恶性疟平均退热时间36小时及疟原虫全部转阴的满意结果。同时还在北京302医院验证了9例，亦均有效。1972年11月20～30日在北京召开的全国各地区“523”办公室主任座谈会上，屠呦呦报告了青蒿乙醚中性提取物首次临床30例抗疟全部有效的结果，引起了与会同道的极大关注。会后，山东、云南等地还去人、去信询问详情，屠呦呦及其课题组都做了积极回应。

青蒿提取方法的创新、抗疟活性化学部分的获得，临床试用有效，是发现青蒿素的关键。